穿心莲内酯诱导髓系白血病细胞株U937和HL60细胞凋亡的实验研究及机制初探

摘要

目的：恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一。全世界每年约有700万人死于肿瘤，我国的肿瘤死亡人数也在百万以上。白血病是造血系统的恶性肿瘤，约占癌肿总发病率的5％左右。白血病的治疗以化疗为主，其作用是全身性的，毒副作用大。虽然有骨髓移植、免疫治疗、基因治疗等治疗手段，但目前药物性化疗仍然是治疗白血病最重要和最基本的方法。化疗最大的缺点是，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常的组织和细胞，引起严重致死性的并发症。因此需要寻找新的更有针对性、低毒高效的治疗药物。现有观点认为中西医结合治疗白血病的疗效优于单纯化疗。中草药可减轻化疗药的毒副作用，提高机体免疫力，并可用于难治性急性白血病（AL）的挽救性治疗。
　　 细胞凋亡（apoptosis）是数十年来在生命科学领域引起广泛兴趣和关注的研究热点。许多天然中草药可以通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，最终诱导触发肿瘤细胞发生凋亡。越来越多的资料表明无论是在杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化、促进凋亡，调整机体免疫功能，改善症状与体征，还是减轻放化疗毒副作用或对肿瘤患者的调理，中草药都发挥着重要作用。近半个世纪来人们越来越关注从传统中草药中提取有效成分用于临床抗肿瘤治疗。
　　 穿心莲内酯（Andrographolide，Andro）是从穿心莲中提取纯化得到的二萜内酯类单体化合物，在抗病毒、诱导细胞分化、抗肿瘤及免疫调节等方面均有活性。穿心莲内酯的抗肿瘤作用机制主要表现为抑制肿瘤细胞增殖、阻滞肿瘤细胞周期进程并诱导细胞凋亡、提高淋巴细胞抗肿瘤活性等方面。
　　 本实验主要观察穿心莲内酯对白血病细胞株U937和HL60的体外增殖抑制和诱导凋亡作用，并对其抗肿瘤作用机制进行初步探讨，为穿心莲内酯作为抗肿瘤药物开发提供理论依据。
　　 方法：
　　 1.采用Cell Counting Kit-8试剂盒（CCK-8）检测不同浓度穿心莲内酯处理白血病细胞株U937和HL60细胞48小时后对U937和HL60细胞的增殖抑制作用，并求出IC50的值。
　　 2.对穿心莲内酯处理过的白血病细胞株U937和HL60细胞以及对照组细胞，采用常规Giemsa染色和Hoechst33342荧光染色，光镜下观察穿心莲内酯作用于细胞后，细胞凋亡的形态学变化。
　　 3.采用流式细胞技术（flow cytometry，FCM）分别检测不同浓度穿心莲内酯（20、40、80μmol/L）作用于U937细胞和HL60细胞48小时后，细胞凋亡变化和细胞周期分布的改变。
　　 4.采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）半定量检测不同浓度穿心莲内酯（20、40、80μmol/L）作用48小时后，U937和HL60细胞内bcl-2、NF-κBmRNA的表达变化。
　　 5.应用Caspase-Glo检测试剂盒及比色法检测穿心莲内酯作用48小时时，诱导U937和HL60细胞凋亡过程中caspase-3/7活力的变化。
　　 结果：
　　 1.穿心莲内酯在1～100μmol/L浓度范围内能明显抑制白血病细胞U937细胞和HL60细胞体外增殖，抑制率呈明显的浓度依赖性，与对照组比较各组间差异有统计学意义（P<0.05），其中100μmol/L穿心莲内酯作用48小时后对U937细胞的抑制率最高，达到83.97％，穿心莲内酯对HL60细胞增殖抑制作用不及U937细胞明显，但作用48小时最高抑制率亦能达到71.64％。不同浓度穿心莲内酯（1、10、100μmol/L）作用48小时U937细胞和HL60细胞半数抑制浓度（IC50）分别为：21.86μmol/l，46.41μmol/l。在此实验结果基础上确定穿心莲内酯的工作终浓度分别为20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L，在此浓度范围内也存在明显的剂量-效应关系，抑制率分别随着药物浓度增加而增加，与对照组相比具有统计学意义（P<0.05）。
　　 2.穿心莲内酯作用后，U937和HL60细胞均出现典型的凋亡特征。普通光学显微镜下形态学表现为细胞体积缩小、染色质聚集、核固缩、核碎裂等；荧光显微镜下表现为凋亡细胞显示荧光标记，胞核浓集而呈亮蓝色或核呈分叶，碎片状，边集。
　　 3.流式细胞技术检测结果显示，穿心莲内酯可诱导急性单核细胞性白血病细胞株U937细胞发生G0/G1期阻滞（由51.30％上升至94.10％），G2/M、S期细胞明显减少；诱导急性粒细胞性白血病细胞株HL60细胞发生S期阻滞（由39.48％上升至67.93％），G0/G1、G2/M期细胞减少。同时两种白血病细胞株产生明显的细胞凋亡.以80μmol/L穿心莲内酯作用48h凋亡率最高，U937细胞达到52.48％，HL60细胞则为17.75％，凋亡不及U937细胞明显。
　　 4.半定量RT-PCR检测结果显示，经不同浓度穿心莲内酯（20、40、80μmol/L）处理48h后，U937细胞中bcl-2 mRNA表达水平随药物作用浓度的增加而降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），NF-κB mRNA的表达水平亦随药物作用浓度的增加而降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。
　　 5.用Caspase-Glo检测试剂盒对caspase-3/7的活力测定实验结果显示，穿心莲内酯处理组Caspase-3/7酶活性增加，与未加药的对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：穿心莲内酯在一定浓度范围内，能抑制白血病U937和HL60细胞增殖，具有明显的剂量效应关系；其对U937细胞和HL60细胞的抑制作用可能与其诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞有关。

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结果

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结论

参考文献

综述 穿心莲内酯抗肿瘤作用研究进展

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