川芎嗪对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质炎症反应及纤维化的影响

摘要

目的：肾间质纤维化是各种原因引起的肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同途径，肾间质纤维化的程度与肾功能损害程度密切相关；小管间质积聚的巨噬细胞（macrophage，MP）可直接或间接参与间质纤维化过程，与肾脏疾病的进展尤为相关[1]，是不可逆性慢性肾损伤的标志。调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子（regulated on activation of normal T cell expressed and secreted，RANTES）是趋化因子家族中的一员，可趋化并激活MP、淋巴细胞和嗜酸粒细胞，引导炎症细胞浸润到肾脏并诱导多种炎症因子的大量表达。巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）是诱导局部MP增殖的关键调控因子[2]，单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠肾组织中M-CSF的增加与局部MP的增殖显著正相关[3]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）调控多种基因表达，参与了许多炎症介质的信号传导过程。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是重要的促纤维化因子，介导了细胞损伤、细胞外基质积聚等诸多过程。川芎嗪为我国常用的活血化瘀中药，其肾保护作用包括抗细胞增殖、抗炎、抗纤维化、免疫调节等多个角度，但其是否有下调RANTES、M-CSF的表达从而使MP浸润减少而抑制肾间质纤维化尚未见报道。本课题拟通过UUO模型，观察川芎嗪对肾间质RANTES、M-CSF、TGF-β1、NF-κB的表达，单核/MP浸润及肾间质纤维化程度的影响，从细胞因子水平探讨川芎嗪对肾间质炎症反应及纤维化的影响。
　　 方法：选择清洁级健康雄性SD大鼠45只，体重180～220克，随机分为三组：假手术组（A组）、UUO组（B组）、川芎嗪治疗组（C组）各15只。将各组大鼠以10％水合氯醛（3.0 ml/kg）腹腔注射麻醉后，分离左侧输尿管并在中上1/3处用4号线上下结扎两处，从中剪断输尿管，以防逆行性感染。假手术组除不结扎和剪断输尿管外，其他手术过程同前。C组大鼠以川芎嗪混悬液40mg/kg/d腹腔注射，术前1天开始给药，1次/日。A组和B组用同体积生理盐水腹腔注射。分别于术后第3、7、14天每组每次随机取5只，快速取出左肾，并处死大鼠。光镜HE、Masson染色观察肾间质病理学改变；免疫组织化学染色测定肾间质RANTES、M-CSF、NF-κB、TGF-β1、CD68+细胞的表达，并对以上实验结果通过图像分析系统进行半定量分析；应用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测RANTES mRNA的表达。所有数据用均数±标准差表示，用SPSS11.5统计软件进行分析，P<0.05为有统计学意义。
　　 结果：①体视学研究：A组大鼠肾脏外观正常。梗阻大鼠的肾体积随梗阻时间的延长而逐渐增大，增大的肾脏内可见明显积水，积液清亮透明，肾实质随梗阻时间延长而逐渐变薄，肾盂扩张，肾盏乳头受压。
　　 ②组织病理学检查：A组肾组织未发现异常。B组术后第3天肾间质水肿，肾小管扩张，小管间质区域出现单核细胞、淋巴细胞浸润。术后第7天上述变化更加明显：间质明显增宽，扩张的肾小管有不同程度的萎缩和坏死，上皮细胞变性、水肿、甚至坏死。术后第14天可见肾间质区域较多炎细胞浸润及肾间质纤维化进行性加重。C组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻。
　　 ③川芎嗪抑制肾间质单核/MP的浸润：A组各时期偶见CD68+细胞浸润（0.034±0.044～0.042±0.043，P>0.05）。B组术后3天可见CD68+细胞在肾间质浸润，并随时间延长而增加（0.268±0.030～0.472±0.048，P<0.05）。C组与B组同时相点相比表达明显减少（0.192±0.068～0.386±0.061，P<0.05），炎症反应减轻。
　　 ④川芎嗪下调肾组织RANTES蛋白及RANTES mRNA表达：A组RANTES蛋白仅微量表达于肾小球或肾间质（0.047±0.020～0.061±0.017，P>0.05）。B组RANTES主要表达于肾小球及肾间质，血管、近曲小管少量表达，且随时间全部呈进行性上升，至第14天达峰值（0.221±0.044～0.453±0.040，P均<0.05）。C组RANTES蛋白在各时相点均明显下调（0.172±0.020～0.374±0.03，P<0.05）。RANTES mRNA水平变化与其蛋白质水平的变化一致，呈明显正相关关系（r=0.520，P<0.05）。
　　 ⑤川芎嗪下调M-CSF的表达：A组肾组织M-CSF微量表达于肾小球或肾间质（0.039±0.032～0.048±0.034，P>0.05）。B组M-CSF主要分布于肾小球及肾间质，近曲小管仅有少量表达，且随着时间延长表达量逐渐增加（0.332±0.051～0.501±0.084，P<0.05）。C组较B组相比表达明显下调（0.242±0.044～0.409±0.029，P<0.05），但仍高于A组。
　　 ⑥川芎嗪可下调促纤维化因子TGF-β1、NF-κB的表达：TGF-β1和NF-κB梗阻术后3天即表达上调，且随着时间延长表达量逐渐增加，至第14天达峰值（分别为0.266±0.004～0.545±0.070，0.270±0.028～0.476±0.054；P均<0.05），较A组（分别为0.025±0.005～0.027±0.001，0.015±0.003～0.017±0.007；P均>0.05）有显著统计学意义（P<0.05）。C组各因子的表达均显著低于同时期B组的表达（分别为0.186±0.006～0.424±0.020，0.217±0.014～0.409±0.062；P均<0.05），但仍高于A组（P<0.05）。
　　 ⑦RANTES、M-CSF、TGF-β1的表达与CD68呈正相关关系（r=0.857、0.565、0.876，P均<0.05），亦与NF-κB的表达呈正相关关系（r=0.832、0.550、0.813，P均<0.05）。
　　 结论：川芎嗪可有效抑制UUO肾组织前炎症因子RANTES、M-CSF及促纤维化因子TGF-β1、NF-κB的过度表达，在早期抑制单核/MP趋化与增殖，从而抑制肾组织炎症反应，减轻肾间质的纤维化。

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结论

参考文献

综述 RANTES与慢性肾脏病

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