BMP2基因转染大鼠颊粘膜成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究

摘要

目的：利用基因转染技术对来源广泛的大鼠颊粘膜成纤维细胞(ratbuccal mucosa fibroblasts RBMF)进行骨形成蛋白2(Bone Morphogenetic Proteins2 BMP2)基因转染，获得BMP2基因转染的口腔颊粘膜成纤维细胞(Bone Morphogenetic Proteins2-rat buccal mucosa fibroblasts BMP2-RBMF)；对BMP2-RBMF的细胞生物学性状进行观察，包括BMP2-RBMF的增殖活性、BMP2蛋白的合成与分泌、碱性磷酸酶活性的表达，探讨BMP2-RBMF作为基因强化组织工程种子细胞的可行性。利用构建的基因强化组织工程的种子细胞BMP2-RBMF与异种烧结骨(Xenogeneic Bone Ceramice XBC)复合，通过检测BMP2-RBMF增殖活性以及应用扫描电镜观察BMP2-RBMF在异种烧结骨中的生长情况，评价异种烧结骨作为支架材料的可行性，为将人BMP2基因转染的成纤维细胞与异种烧结骨复合进行颌骨缺损及牙体修复的研究奠定基础。
　　 方法：
　　 1大鼠颊粘膜成纤维细胞（RBMF）的培养与来源鉴定
　　 2 pEGFP-N1-BMP2表达载体的构建与鉴定
　　 3 BMP2基因转染RBMF及筛选
　　 4 BMP2基因转染对RBMF生物学特征的影响
　　 4.1荧光显微镜观察BMP2-RBMF中BMP2蛋白的表达
　　 4.2 RT-PCR检测BMP2-RBMF中BMP2基因的表达
　　 4.3 MTT法检测BMP2-RBMF增殖活性
　　 4.4透射电镜观察BMP2-RBMF超微结构
　　 4.5免疫组化观察BMP2-RBMF中BMP2蛋白的表达
　　 4.6 BMP2-RBMF碱性磷酸酶活性检测
　　 4.7酶联免疫吸附试验观察BMP2-RBMF分泌BMP2蛋白情况
　　 5 BMP2-RBMF细胞复合异种烧结骨支架材料体外培养
　　 5.1 MTT法检测BMP2-RBMF增殖活性
　　 5.2扫描电镜观察BMP2-RBMF与异种烧结骨复合情况
　　 结果
　　 1成纤维细胞形态学观察
　　 倒置相差显微镜下观察发现，原代成纤维细胞3-5天由组织块中爬出，贴壁、展开，呈梭形、三角形、多边形；刚传代的成纤维细胞呈球形，悬浮于培养瓶中，传代后2h存活细胞沉降贴壁，24h内完全伸展，胞核明显，胞体丰满。
　　 2成纤维细胞来源鉴定
　　 成纤维细胞波形丝蛋白免疫荧光染色阳性，细胞胞浆着色（绿色荧光），胞核不着色。细胞角蛋白免疫荧光染色阴性，胞浆胞核均无绿色荧光。说明培养细胞为来源于中胚层的成纤维细胞。
　　 3 pEGFP-N1-BMP2重组质粒的鉴定
　　 对构建的BMP2真核重组质粒用XhoⅠ、HindⅢ进行双酶切，其产物进行琼脂糖凝胶电泳后，在1.2kb、4.7kb可见两条特异条带；并进行全基因序列测序，报告100％符合，证明pEGFP-N1-BMP2重组质粒构建成功。
　　 4 pEGFP-N1-BMP2质粒转染的RBMF在荧光显微镜下观察
　　 RBMF转染后24h荧光显微镜下观察，可见大量细胞发出绿色荧光，其中，pEGFP-N1质粒转染组绿色荧光均匀分布在整个细胞，pEGFP-N1-BMP2质粒转染组绿色荧光分布在细胞胞浆和细胞膜，细胞核中无荧光。
　　 5细胞增殖活性
　　 MTT法检测RBMF、N1-RBMF、BMP2-RBMF增殖活性，统计结果显示BMP2-RBMF与RBMF、N1-RBMF增值活性差别无显著性(P＞0.05)，即pEGFP-N1-BMP2质粒转染不影响RBMF的增殖活性。
　　 6细胞免疫组化检测BMP2-RBMF中BMP2蛋白的表达
　　 BMP2-RBMF可见有BMP2蛋白的阳性表达，细胞胞浆及胞膜被染成棕色，胞核未着色。RBMF、N1-RBMF中BMP2蛋白的表达阴性。
　　 7 RT-PCR检测BMP2-RBMF中BMP2基因表达
　　 应用RT-PCR技术可检测到BMP2-RBMF中有BMP2基因表达，RBMF、N1-RBMF中未检测到BMP2基因表达。
　　 8碱性磷酸酶(ALP)活性检测
　　 BMP2-RBMF的ALP活性较RBMF、N1-RBMF有所提高，统计结果显示差异有显著性(P＜0.05)，即pEGFP-N1-BMP2质粒转染可提高成纤维细胞碱性磷酸酶的活性。
　　 9 BMP2-RBMF上清中BMP2蛋白的表达
　　 BMP2-RBMF培养上清液光密度值明显高于RBMF、N1-RBMF，统计结果显示差异有显著性(P＜0.05)即pEGFP-N1-BMP2质粒转染可促进成纤维细胞分泌BMP2。
　　 10透射电镜观察BMP2-RBMF
　　 细胞表面突起增多；细胞质内见大量呈板层状排列或同心圆状的髓样化结构，粗面内质网普遍扩张，内有中等电子密度的蛋白质沉淀，粗面内质网膜表面核糖体分布较密集；在细胞膜的部位，可见大量呈串珠样排列的电子密度较低的小泡，附近有电子密度较高的颗粒样物质。
　　 11 MTT法检测与异种烧结骨复合的BMP2-RBMF细胞增殖情况
　　 BMP2-RBMF复合异种烧结骨组细胞增殖活性与单层贴壁培养BMP2-RBMF组细胞增殖情况差异无显著性(P＞0.05)。说明异种烧结骨上黏附的细胞增殖情况良好。
　　 12扫描电镜观察异种烧结骨上BMP2-RBMF黏附、生长的情况
　　 可见异种烧结骨的孔径为100-600μm，材料表面粗糙，利于细胞的黏附生长；孔隙中可见大量BMP2-RBMF，BMP2-RBMF贴附于材料上，生长旺盛、伸展良好。
　　 结论：
　　 1骨形成蛋白2(BMP2)基因转染大鼠口腔颊粘膜成纤维细胞(RBMF)，可以稳定表达BMP2，对细胞增殖无影响。
　　 2 BMP2-RBMF具有成骨细胞的表型，可以作为组织工程的种子细胞。
　　 3 BMP2-RBMF可分泌BMP2，参与诱导成骨作用。
　　 4 BMP2-RBMF可在异种烧结骨表面及孔隙中生长、增殖，异种烧结骨可以作为骨及牙组织工程的支架材料。
　　 总之：BMP2-RBMF与异种烧结骨复合可作为颌骨及牙本质修复的组织工程材料，有待于下一步进行动物实验及临床应用。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

BMP2基因转染大鼠颊粘膜成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 BMP在成骨和成牙本质中的研究进展

参考文献

致谢

个人简历