大鼠骨髓间充质干细胞侧脑室植入对SAH后CVS大鼠的影响

摘要

一、大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及神经元条件培养基对其定向诱导分化
　　 二、大鼠SAH后CVS模型制备及行为学、生物学指标测定
　　 三、BrdU标记的BMSCs侧脑室植入后对SAH后CVS大鼠行为学影响的研究
　　 目的：通过BMSCs侧脑室植入SAH后CVS大鼠，观察标记的BMSCs在大鼠脑内生长情况，结合行为学检测评价BMSCs植入后效果。
　　 方法：第5代BMSCs，用5-溴脱氧尿核苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）标记2d。将标记后的细胞爬片进行免疫细胞化学染色，一抗为BrdU抗体。标记好的细胞以5×106的细胞悬液侧脑室注入SAH后的大鼠。SAH大鼠以其神经功能评分为参照，随机分为三组：SAH组、SAH后植入DMEM组和SAH后BMSCs植入组。SAH组不植入干细胞，而DMEM组于第二次注血2d后立体定向仪下用微量注射器注入30μLDMEM培养基。BMSCs组在第二次注血后2d立体定位仪下注入30μL的BMSCs悬液。BMSCs组中5只大鼠于14d后进行Morris水迷宫检测，另外5只取脑进行免疫组化染色。脑立体定位仪下大鼠侧脑室穿刺取前囟定位，前囟后1.2mm，中线旁2mm处进针，接上已事先抽好BMSCs悬液或是DMEM的微量注射器，深度为4.5mm，将30μLBMSCs悬液或DMEM培养基缓慢注入侧脑室。各组大鼠在注射后14d麻醉，固定取脑，切片，进行免疫组化染色，H2O2灭活内源性酶，加入抗原修复液，生物微波炉加热抗原修复，滴加5％BSA封闭液，一抗（小鼠抗BrdUIgG），37℃1h，生物素化二抗，37℃20min，DAB染色，脱水透明，中性树胶封片。SAH组及DMEM组、BMSCs组1d、2d、3d、5d、7d后行神经生物学功能评分，于14d后进行水迷宫检测。
　　 结果：BrdU标记后BMSCs，经免疫细胞化学染色为胞核着色，以胞核呈棕黄色者为阳性。脑立体定位仪下行侧脑室穿刺，以前囟定位，能准确注入侧脑室。SAH大鼠侧脑室穿刺注入干细胞悬液后无不良反应。脑石蜡切片DAB染色后，可见经BrdU标记的阳性细胞胞核呈棕褐色，阳性细胞在切片内无明显规律，散在分布于阴性细胞之间。DMEM组可见阴性细胞核仍呈蓝色。将SAH组、DMEM组及BMSCs组大鼠于注射后1d、2d、3d、5d、7d进行神经生物功能评分，无论是SAH组还是DMEM、BMSCs组可见，在各组里以1d神经生物学功能评分普遍高于其它组（P<0.05），以后评分逐渐下降，BMSCs组大鼠在7d时与DMEM和SAH组相比，神经生物功能评分明显减低，感觉运动功能恢复（P<0.05）。Morris水迷宫检测BMSCs组大鼠平均逃避潜伏期时间比SAH组和DMEM组要短，有统计学差异，探索实验显示BMSCs组跨越平台的次数多于其它两组，差异有明显统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：1BrdU可以用来标记BMSCs，标记后的细胞可用相应的抗体检测。2脑立体定位仪下以前囟后1.2mm，中线旁2mm处进针，深度为4.5mm的位置能准确注入侧脑室，注射后大鼠未见明显不良反应。3注入BrdU标记过的BMSCs后，取前囟后4mm的海马组织切片免疫组化染色显示有BrdU阳性细胞存在。4生物学功能评分可见BMSCs组在7d时评分下降，表明感觉和运动功能有一定程度的恢复。5Morris水迷宫显示BMSCs组在学习记忆能力方面也有一定的改善。
　　 四、SAH后CVS大鼠移植BMSCs后海马神经元凋亡的研究目的：大鼠SAH后CVS模型基础上植入BMSCs，大鼠感觉、运动功能有一定程度的恢复，进一步观察BMSCs植入后对大鼠脑内海马神经元凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。
　　 方法：在第三部分大鼠脑组织切片基础之上，取SAH组、DMEM组和BMSCs组14d前囟后4mm处大脑皮层及海马组织石蜡切片，以兔抗鼠Bcl-2和Bax为一抗，进行免疫组织化学染色。图像分析软件分析阳性细胞数目比率。无菌条件下取SAH及BMSCs14d组大脑，剥出海马，按每100mg脑组织加入1mL，裂解液，超声裂解后低温离心，取上清，考马斯亮兰测定蛋白含量，蛋白变性后上样，电泳、转硝酸纤维素膜（NC膜），脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗大鼠Bcl-2、Bax一抗，4℃静置过夜。滴加辣根过氧化物酶标记二抗，免疫化学发光，X光片显影定影。使用Hema成像分析系统对显色条带进行半定量分析，测定各组蛋白相对表达水平。
　　 结果：与SAH组相比，BMSCs组海马可见Bcl-2阳性细胞数目增加，细胞呈黄褐色，深染；Bax阳性细胞数目减少，着色较浅。SAH组大鼠海马可见Bcl-2阳性细胞数目较少，着色浅；相反Bax阳性细胞数目增加，细胞呈棕褐色较深。DMEM组可见Bax阳性细胞数目增加，而Bcl-2阳性细胞数目相对减低。Westernblot显示，DMEM组、SAH组和BMSCs组大鼠海马GAPDH表达三组基本相似，Bcl-2在BMSCs组比DMEM组和SAH组表达高（P<0.05）。Bax的表达在SAH组与DMEM组高于BMSCs组，相比有明显统计学差异（P<0.05）。
　　 结论：1SAH后CVS模型大鼠侧脑室植入BMSCs后，大脑皮层和海马内可见神经元抑制凋亡相关基因表达增加，而促凋亡相关基因表达下降。2SAH组14d大鼠脑内促凋亡相关基因表达升高，抑制凋亡相关基因表达下降。3DMEM组大鼠脑内仅有少量的抑制凋亡相关基因表达，促凋亡相关基因表达较高。
　　 五、SAH后CVS大鼠侧脑室植入BMSCs脑血管超微结构观察与血中NOS、ET-1含量变化目的：观察SAH后CVS大鼠侧脑室植入BMSCs后血中一氧化氮合酶、内皮素-1含量变化，同时透射电镜观察大鼠脑内血管和神经元超微结构改变，为细胞移植治疗提供理论和实验依据。
　　 方法：实验动物分组、SAH模型制备及BMSCs移植同前面几部分，分为正常对照组、SAH组及BMSCs组。于移植BMSCs后1d、3d、7d进行取血，测定大鼠血中NOS和ET-1含量，具体方法同前面第二部分。同时取前囟后4mm大脑皮层脑组织约1mm×1mm×2mm大小，用2.5％戊二醛磷酸盐缓冲液中后固定1d，备透射电镜检查。将标本用0.1M磷酸缓冲液洗3次，质量分数为1％锇酸固定，逐级梯度乙醇、丙酮脱水，环氧树脂812包埋，聚合，用超薄切片机作0.5μm厚度切片，经1％甲苯胺蓝-天青Ⅱ染色，光镜下定位后制作超薄切片，片厚约50nm，铜网捞片，醋酸铀、柠檬酸铅液染色。日立H-7500型透射电镜观察各组大鼠大脑皮层神经元及微血管的超微结构，照相，记录。组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果：与对照组相比，SAH组后1d、3d、7d血中NOS含量明显下降，而血中ET-1含量则明显上升，其中以SAH3d组血中ET-1升高最为明显，差异有统计学意义。与SAH组相比，BMSCs组可见血液中ET-1含量逐渐下降，而NOS含量上升，差异有统计学意义。与正常组相比，BMSCs组ET-1含量仍然较高，差异有明显统计学意义（P<0.05），血中NOS含量有一定下降，与对照组相比不能说明有差异（P>0.1）。透射电镜显示，对照组神经元细胞核大而圆，染色质密度均匀，核仁明显，核膜完整。大脑皮层毛细血管可见其内皮细胞内膜光滑，细胞核、细胞器、紧密连接清晰可见，内皮细胞的基质和基膜完整，层次清楚，管腔无狭窄。SAH组可见大脑皮层神经元和微血管内皮细胞的水肿程度达到高峰，神经元高度水肿，线粒体肿胀，可见部分凋亡、坏死神经元。BMSCs组大脑皮层神经元和微血管内皮细胞可见轻度水肿，血管内皮细胞的吞饮小泡略减少。微血管内皮细胞核固缩，管腔内微绒毛减少，管腔狭窄有一定缓解。
　　 结论：1SAH后CVS大鼠侧脑室移植BMSCs后ET-1下降，NOS含量升高。说明脑血管痉挛有一定程度的缓解。2脑组织及血管超微结构观察，SAH组大脑皮层神经元坏死加重，部分微血管闭塞。BMSCs移植后神经元的凋亡与死亡减少，微血管闭塞有一定的缓解。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

引言

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及神经元条件培养基对其定向诱导分化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 大鼠SAH后CVS模型制备及行为学、生物学指标测定

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 BrdU标记的BMSCs侧脑室植入后对SAH后CVS大鼠行为学影响的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 SAH后CVS大鼠移植BMSCs后海马神经元凋亡的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分 SAH后CVS大鼠BMSCs移植前后脑血管的超微结构观察与血中NOS、ET-1含量变化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 脑血管痉挛发病原因的分子机制研究现状

参考文献

综述二 动脉瘤性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的预防和治疗进展

参考文献

致谢

个人简历