二氮嗪预处理H2O2损伤L6骨骼肌成肌细胞的作用

摘要

目的:缺血性心脏病是严重危害人类健康的疾病之一,目前的治疗包括药物治疗、介入、外科手术等治疗,虽然在一定程度上延缓了病程的发展,但却不能逆转己坏死的心肌,无法中断心衰的进展。细胞移植为病损心脏的细胞重建及衰竭心脏的功能恢复,提供了一种崭新的方法。研究结果表明干细胞移植能促进心脏血管和心肌细胞的新生,改善心肌血液供应,增强心脏功能。在细胞移植的众多研究中,骨骼肌成肌细胞移植因有更广泛的临床应用前景更是受到科学家的青睐。骨骼肌成肌细胞存在于骨骼肌肌膜和基膜之间,是骨骼肌细胞的前体细胞。骨骼肌成肌细胞作为供体细胞有很多理想的特性,如在体外未分化状态有增殖能力,在缺血组织内仍然能够成活,用自体成肌细胞移植,无免疫排斥反应,可作为基因的载体等。这些优点使骨骼肌成肌细胞成为心脏干细胞移植主要的干细胞种类之一。但是移植后干细胞在宿主心肌受损的微环境中存活率极低,严重影响细胞治疗的效果。急性心梗后氧化酶与抗氧化酶的平衡被打破,活性氧化物(reactive oxygen species,ROS)在心梗区和非心梗区均升高,氧化应激持续存在。梗死心脏中增高的活性氧化物是诱导移植细胞凋亡的重要因素。减少缺血应激时的细胞凋亡,提高移植细胞存活率,增强细胞移植的治疗效果是目前急需解决的问题。本研究采用过氧化氢(H2O2)体外诱导L6骨骼肌成肌细胞(L6 Skeletal Myoblast,L6SkM)损伤,建立L6SkM氧化应激损伤模型,观察二氮嗪(diazoxide,DZ)预处理对氧化应激损伤L6SkM的作用,意图寻找提高移植细胞存活率、增强治疗效果的有效方法。
　　 方法:
　　 1、不同浓度H2O2对L6SkM的作用体外培养L6骨骼肌成肌细胞(L6Skeletal Myoblast,L6SkM),用H2O2诱导L6SkM损伤。实验分正常对照组(normal control),H2O2损伤1-5组(H2O2 group,浓度分别为0.10、0.50、1.00、1.20、1.50mmol/L,作用时间为12小时、24小时、36小时)。通过MTT比色法检测各组细胞活力,摸索诱导H2O2氧化损伤的适当浓度及时间,建立L6SkMH2O2氧化应激损伤模型。
　　 2、不同浓度DZ预处理对L6SkM的作用体外培养L6骨骼肌成肌细胞(L6SkM),实验分正常对照组(normal control),H2O2损伤组(H2O2group,1.00mmol/L,24hours),DZ预处理1-4组(DZ group):在培养基中先加入终浓度为50umol/L、100umol.L、200umol/L、400umol/L的二氮嗪孵育30分钟,再换为含1.00mm01/LH2O2的培养基作用24小时诱导损伤。通过MTT比色法检测各组细胞活力,观察不同浓度二氮嗪预处理对过氧化氢损伤后细胞活力的影响,摸索DZ的适当浓度,建立DZ预处理L6SkM的保护实验模型。
　　 3、DZ预处理对H2O2损伤L6SkM的作用体外培养L6骨骼肌成肌细胞(L6SkM)。实验分正常对照组(normal control),H2O2损伤组(H2O2 group,1.00mmol/L,24hours),DZ预处理组(DZ group,200umol/L,30min+H2O2损伤)。MTT比色法检测各组细胞活性:检测各组培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量并计算LDH的释放率,评估细胞膜损伤情况;光镜、电镜观察细胞的形态学变化;流式细胞术测定细胞凋亡率、细胞周期;免疫细胞化学染色检测CytC、PCNA、Bcl-2、Bax的表达;western-blot法检测Bcl-2、Bax的表达水平。
　　 结果:
　　 1、不同浓度H2O2对L6SkM的作用MTT检测结果提示,随着H2O2浓度的升高,作用时间的延长,细胞活力(OD值)逐渐降低,呈明显的剂量和时间依赖性。我们选择引起细胞活力下降45％左右的H2O2浓度(1.00mmol/L)作用24h,建立L6SkM损伤模型。
　　 2、不同浓度DZ预处理对L6SkM的作用MTT检测结果提示,经DZ预处理后,细胞活力(OD值)呈上升趋势。与H2O2组相比较,DZ100umol/L、200umol/L、400 umol/L浓度组细胞吸光度值(OD值)显著上升。200umol/L与400 umol/L浓度组之间吸光度值无统计学差异,我们选择200umol/LDZ孵育30min建立保护实验模型。
　　 3、DZ预处理对H2O2损伤L6SkM的作用
　　 3.1 MTT检测显示,与正常对照组比较,H2O2组的细胞活力明显下降;与H2O2组比较,DZ组的细胞活力明显上升;DZ组与正常对照组的细胞活力相比较无明显差异。
　　 3.2 LDH检测显示,与正常对照组比较,H2O2组的LDH含量明显增高:与H2O2组比较,DZ组的LDH含量明显降低,但仍高于正常对照组。
　　 3.3 L6SkM的形态变化,H2O2组的L6SkM收缩,部分变成圆形,核收缩变小,核质致密浓染或呈碎块状致密浓染;电镜显示部分细胞表面出现较多的球状突起及皱褶,细胞核异染色质边集,并逐渐凝聚成新月状附于核膜周边。DZ预处理可明显改善H2O2所致的L6SkM损伤表现。
　　 3.4流式细胞仪分析,DZ预处理可以减少H2O2诱导的L6SkM凋亡,促进L6SkM增殖。
　　 3.5免疫细胞化学染色检测显示,与正常对照组相比,H2O2组PCNA、Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达明显增加;与H2O2组相比,DZ组PCNA、Bcl-2蛋白表达明显上升,Bax蛋白表达下降。与正常对照组相比,DZ组PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表达无明显差异。H2O2组部分细胞细胞色素C的免疫反应性明显增强并呈弥漫性片状分布,表明细胞色素C由线粒体释放到胞质;DZ组与正常对照组细胞胞浆中棕黄色颗粒分布均匀,染色浅,表明细胞色素C存在于线粒体中。
　　 3.6 Western-blot法检测显示,H2O2组Bcl-2蛋白表达明显低于正常对照组,而Bax蛋白表达明显高于正常对照组;DZ组Bcl-2蛋白表达明显高于H2O2组,Bax蛋白表达明显低于H2O2组;DZ组Bcl-2蛋白表达上升,但还是低于正常对照组,两组存在差异,而Bax蛋白表达,两组间无差异。
　　 结论:
　　 1、H2O2可诱导L6SkM损伤,并且具有浓度和时间依赖性。我们选择使细胞活力下降45％左右的1mmol/L H2O2,作用L6SKM24小时为适合本实验研究的最佳条件。
　　 2、二氮嗪预处理对氧化应激损伤L6SkM具有保护作用,其可以维持细胞膜、线粒体膜的完整,防止细胞形态结构发生改变,促进增殖,抑制凋亡,从而减轻氧化应激损伤。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 预处理在干细胞移植治疗心梗中的作用机制

致谢

个人简历