PI3K/PKB信号通路在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞凋亡中的作用

摘要

目的：慢性乙型肝炎( Chronic Hepatitis B，CHB)是威胁人类健康的传染病之一，主要是由乙肝病毒持续感染引起。乙肝病毒是嗜肝病毒，主要通过免疫损伤引起肝细胞的破坏，如不及时清除将会引起肝脏反复的炎症，最终导致肝硬化，甚至肝癌。
　　 迄今为止，乙型肝炎慢性化的发病机制尚不十分清楚，许多研究已经证实慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B，CHB)的发病机制与机体的细胞免疫功能低下密切相关，但CHB患者细胞免疫功能低下的机制尚未完全阐明。近年来，T淋巴细胞“激活诱导细胞死亡( activation induced cell death，AICD)”与慢性乙型肝炎的关系已引起人们的高度关注。AICD是指一种再活化淋巴细胞的凋亡，即已活化的成熟淋巴细胞(T或B)再次受到激活信号（特别是TCR/CD3复合体）激活后，诱导自身Fas及FasL、TNF及其配体等凋亡效应因子的表达，通过配体-受体的相互作用，传递细胞凋亡信号，导致细胞自身凋亡。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)主要由淋巴细胞组成，还包括单核巨噬细胞及自然杀伤细胞等免疫活性细胞，在机体的免疫反应尤其是细胞免疫反应中起重要的作用，检测PBMC凋亡状况可大体反映外周血淋巴细胞凋亡状况。有研究发现CHB患者外周血淋巴细胞和PBMC发生AICD的比率比正常人高，提示HBV可能通过诱导PBMC凋亡增多，造成免疫细胞数量减少或活性下降，使CHB患者免疫功能低下，而使HBV感染得以持续，所以由HBV所致的淋巴细胞活化后诱导凋亡过多可能是造成乙肝慢性化及形成免疫耐受的重要的机制之一，但是其凋亡机制目前尚不清楚。因此如何减少CHB患者PBMC的AICD，改善cHB患者的细胞免疫功能，将是打破免疫耐受状态、清除慢性乙型肝炎患者体内HBV的可能途径。目前关于其凋亡途径的研究主要集中于由Fas/FasL等介导的死亡受体凋亡途径和Bcl-2家族调控的线粒体凋亡途径，认为死亡受体途径和线粒体途径可能在CHB患者PBMC的AICD过程中起着重要的作用。
　　 PI3K(phosphatidylinositoI3-kinase，磷脂酰肌醇3-激酶)/PKB(proteinkinase B，蛋白激酶B)信号通路在抑制细胞凋亡方面起着至关重要的作用。FOXO3a(FKHRL1)是PI3K/PKB信号转导途径下游重要的靶基因，是Forkhead转录因子家族成员之一。未被磷酸化的FOXO3a(FKHRL1)存在于细胞核中，通过激活促凋亡基因（FasL、TRAIL、Bim等）的转录，介导死亡受体途径和线粒体途径的凋亡。一旦被PKB磷酸化，FOXO3a就离开细胞核，失去其转录活性。细胞受到细胞外信号刺激后，使细胞膜上的PI3K活化，活化的PI3K可以使PK13磷酸化激活(即p-PKB)，p-PKB可以使促凋亡转录因子FOXO3a(FKHRL1)磷酸化失活，磷酸化的FOXO3a与DNA亲和力下降，从细胞核转移至细胞质，并与细胞质中的伴侣蛋白14-3-3蛋白结合，阻止FOXO3a蛋白逆转运至细胞核内，从而抑制FOXO3a的转录活性，抑制其对下游促凋亡基因Bim的转录和翻译，抑制促凋亡蛋白Bim的表达，发挥抑制细胞凋亡的作用。有研究发现在T淋巴细胞的AICD过程中，激活PI3K/PKB信号通路可以降低淋巴细胞的AICD，而抑制PI3K/PKB信号通路可以促进淋巴细胞AICD的过程。PI3K/PKB信号通路是否参与了CHB患者PBMC的AICD过程，目前此方面的研究尚无报道。为此，我们以CHB患者PBMC为研究对象，体外模拟AICD过程，观察PI3K/PKB信号通路中p-PKB，总PKB及其下游的FOXO3a转录因子、Bim蛋白的表达情况和PBMC的凋亡率，以及被激活剂胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)激活PI3K/PKB信号通路后，上述蛋白的表达和PBMC凋亡率的变化，探讨PI3K/PKB信号通路对慢性乙型肝炎患者AICD的影响，为慢性乙肝的治疗提供一定的理论基础。
　　 方法：
　　 1 入选标准和排除标准：
　　 选取慢性乙型肝炎患者共40例，其中男性22例，女性18例，年龄在18岁-60岁之间，平均年龄35岁，随机分成两组，慢性乙肝组和慢性乙肝+激活剂组。慢性乙型肝炎患者HBVDNA均阳性(1×103copies/ml≤HBVDNA＜1×107copies/ml)，肝功能异常，ALT高于正常值上限2倍以上，诊断标准符合2005年中华医学会制定的“慢性乙型肝炎防治指南”，乙型肝炎标志物HBsAg阳性、HBeAg或抗-HBe阳性和抗-HBc阳性。排除HAV、HCV、HDV、HEV和HIv感染，排除近3个月应用糖皮质激素、干扰素等影响免疫功能药物的患者，除外应用抗病毒药物治疗的患者，及近期有急性感染患者。健康对照20例，男12例，女8例，年龄在18岁45岁，平均年龄30岁，取自健康献血员。
　　 2 PBMC提取、培养：
　　 无菌条件下抽取肝素抗凝血4mL，应用密度梯度离心法分离PBMC分离成功的PBMC加入植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)100μg/ml刺激培养16-18小时，弃去PHA，加入外源性IL-21000U/L进行培养至少5天后，用抗CD3抗体500ug/ml重新刺激48小时。其中慢性乙肝+激活剂组用抗CD3抗体重新刺激之前加入IGF-1(insulin likefactor-1)100ng/ml预处理20分钟。
　　 3 细胞凋亡的检测
　　 培养的细胞用70％乙醇固定，4℃离心去掉固定液，并用冷PBS洗2次，加入含有RaseA的PI染液约1000μL，室温静置30分钟后上流式细胞仪检测凋亡率。
　　 4p-PKB、总PKB、p-FOXO3a和Bim蛋白的检测
　　 剩余细胞，提取蛋白后，-80℃保存，待收集够标本后集中行Westernb1ot检测p-PKB、总PKB、p-FOXO3a和Bim蛋白的表达情况。
　　 结果：
　　 1 经抗CD3抗体刺激48h后，慢性乙肝组外周血单个核细胞凋亡率(28.27％±4.61％)高于健康对照组（19.36％±5.90％），差异有统计学意义(P＜0.05)。也高于慢性乙肝+激活剂组(22.69％±3.47％)，差异有统计学意义(P＜0.05)。慢性乙肝+激活剂组凋亡率（22.69％±3.47％）高于健康对照组(19.36％±5.90％)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2 慢性乙肝组p-PKB蛋白的表达量低于健康对照组(0.44±0.09vs0.55±0.10，t=3.649，P＜0.01)，也低于慢性乙肝+激活剂组(0.44±0.09vs0.76±0.17，t=7.618，P＜0.01)。总PKB蛋白在三个组的表达差异无统计学意义。慢性乙肝组p-FOXO3a蛋白的表达量低于健康对照组(0.31±0.07vs0.43±0.05，t=6.131，P＜0.01)，也低于慢性乙肝+激活剂组(0.31±0.07vs0.63±0.11，t=10.979，P＜0.01)。慢性乙肝组Bim蛋白的表达量高于健康对照组(0.96±0，15vs0.58±0.12，t=9.110，P＜0.01)，也高于慢性乙肝+激活剂组(0.96±0.15vs0.53±0.10，t=10.997，P＜0.01)。
　　 3 慢性乙肝组患者PBMC中p-PKB蛋白的表达与凋亡率成负相关（r=-0.839，P＜0.01)。
　　 结论：
　　 1 慢性乙型肝炎患者PBMC存在AICD现象，且凋亡率较正常人高，这可能是造成慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能低下、免疫耐受的一个重要原因。
　　 2 慢性乙型肝炎患者存在PI3K/PKB信号通路受抑制现象，PBMC的凋亡增多可能与PI3K/PKB信号通路活性减弱有关。
　　 3 PI3K/PKB信号通路参与了慢性乙型肝炎患者PBMC的AICD过程，可能是引起慢性乙肝患者PBMC凋亡率增高的机制之一。

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PI3K/PKB信号通路在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞凋亡中的作用

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结果

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结论

参考文献

综述 PI3K/Akt信号通路在临床中的研究进展

参考文献

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