Ephrin-B2基因敲除小鼠脑损伤后反应性星形胶质细胞有利于保护组织和促进神经功能恢复

摘要

创伤性脑损伤(Traumatic brain iniury,TBI)是神经外科最常见的疾病,是致死和致残的主要原因,尤其是青少年。近年来,随着神经外科治疗方法和治疗药物的不断改进、创新,已显著降低了其死亡率,提高了预后,但治疗后的神经功能恢复情况仍不太令人满意,脑损伤后神经功能障碍发生率较高,多数患者遗留学习记忆能力减弱、肢体功能障碍等问题,这些严重影响了人们的生活质量。如何减少后遗症,提高治疗效果,尤其是认知功能和运动能力的改善,一直是神经科学界努力探索追求的目标。近来,增强脑损伤后的神经保护、减少继发性炎症反应、促进组织修复,愈来愈成为神经医学界关注的焦点。Ephrins配体及Eph受体(产生促红细胞生成素的肝细胞受体,Erythropoietin-Producing Hepatocellular Receptor)统称为Eph受体家族,是新发现的酪氨酸蛋白激酶信号传导系统,Ephrin-B2是该系统中的一名重要成员,参与神经细胞间多种作用。在胚胎发育阶段,对神经系统的发育及血管的生成起非常重要的作用;在成年时,它仍然参与细胞间的信号传导,从而影响细胞行为和组织塑形,如诱导细胞迁移和边界形成,特别是在脑损伤后的修复过程中。
　　 目的:培育条件性Ephrin-B2基因敲除小鼠,敲除胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性星形胶质细胞内的Ephrin-B2基因;建立TBI动物模型;探讨Ephrin-B2基因在小鼠脑损伤后表达规律及神经损伤修复过程中的作用。
　　 方法:
　　 1 培育Ephrin-B2基因敲除(KO)小鼠:将GFAP-Cre基因型小鼠和Ephrin-B2-LoxP基因型小鼠进行杂交繁殖后代,检测子代小鼠的基因型。
　　 2 对Ephrin-B2基因敲除小鼠进行健康检测,以C57BL/6野生型(WT)小鼠作为对照,比较神经系统的大体形态,星形胶质细胞形态、数量及分布。
　　 3 选择雄性、10～12周、重20～30g、健康的Ephrin-B2基因敲除小鼠120只,相同数量的健康、雄性C57BL/6野生型小鼠作为对照,建立可控性皮层损伤模型。
　　 4 将两种TBI小鼠,按四个时间点:3天、7天、14天和21天各分为4组,将无损伤的小鼠作为空白对照。于各时间点采集标本,进行以下检测:免疫荧光组织化学染色检测脑损伤后Ephrin-B2蛋白和GFAP的表达、分布情况;Western blotting检测损伤周围Ephrin-B2蛋白、磷酸化的Ephrin-B2(pEphrin-B2)蛋白和GFAP的表达改变;Q-PCR检测损伤周围及损伤同侧海马区域GFAP mRNA表达的动态变化;Nissl染色检测损伤后21天时的损伤体积;采用平衡木行走试验(Beam Walking Test)和转圈试验(Rotarod Test)进行神经功能行为学评分。
　　 5 星形胶质细胞划痕损伤试验:将两种小鼠脑皮层星形胶质细胞培养,免疫荧光组织化学染色检测星形胶质细胞Ephrin-B2蛋白和GFAP的表达情况,并检测在损伤后两种星形胶质细胞长入损伤区域的细胞数目,检测在修复过程中的不同表现。
　　 结果:
　　 1 Ephrin-B2基因敲除小鼠表现形与C57BL/6野生型小鼠相似,无明显差别:全脑的大小,重量以及形态相同,显微镜下检测星形胶质细胞形态,大小和分布亦与野生型小鼠无差别,Western Blotting检测显示KO小鼠脑皮层GFAP表达略高于WT小鼠。
　　 2 免疫组织学染色显示Ephrin-B2蛋白在WT小鼠脑损伤后21天内在损伤周围表达逐渐增加,Ephrin-B2蛋白主要表达于GFAP阳性的星形胶质细胞膜和突起上。KO小鼠脑损伤后损伤周围无Ephrin-B2蛋白表达。
　　 3 Western blotting结果显示WT小鼠脑损伤后Ephrin-B2,pEphrin-B2和GFAP的表达在损伤周围明显增加。尽管Ephrin-B2蛋白表达在脑损伤后第3天时稍下降,但是在3天以后逐渐升高,在21天时最高。pEphrin-B2和GFAP的表达曲线表现为相同的改变趋势,在第7天时表达量最高。
　　 4 Western blotting结果还显示KO小鼠在脑损伤后GFAP的表达明显高于WT小鼠。WT小鼠GFAP的表达在第7天时最高,而KO小鼠GFAP的表达在21天内持续升高,在第3天时KO小鼠GFAP的表达是WT小鼠的4.7倍,在第7天时是WT小鼠表达量的2.8倍,在第14和21天KO小鼠GFAP的表达仍明显高于WT小鼠。Q-PCR方法检测KO小鼠GFAP mRNA的表达均较WT小鼠呈明显增加(p＜0.05),无论是在损伤周围还是在同侧海马区域,这与GFAP的表达趋势相同。
　　 5 Nissl染色示Ephrin-B2基因敲除小鼠在脑损伤后21天时形成的损伤空洞体积较小。
　　 6 细胞培养结果显示Ephrin-B2基因敲除后的星形胶质细胞在损伤后更易于分裂增殖,更快向损伤区域聚集。
　　 7 行为学评分示Ephrin-B2基因敲除小鼠在脑损伤后神经功能恢复较好。
　　 结论:WT小鼠脑损伤后,Ephrin-B2配体在损伤周围的星形胶质细胞膜上表达明显上调,信号传导增加;Ephrin-B2基因敲除小鼠脑损伤后,Ephrin-B2配体不再表达,致使星形胶质细胞活化迅速且明显增多,在损伤后3天时,GFAP mRNA的表达就已明显增高,GFAP合成增加,反应性的星形胶质细胞增加了神经保护作用,减轻了继发性组织损伤,从而促进了损伤修复和脑神经功能的恢复,减少了后遗症的发生。因此,如何定时定量地调节Ephrin-B2的信号传导,从而调控星形胶质细胞的活性,减少继发性组织损伤,扩大损伤后星形胶质细胞的保护作用,有望成为治疗颅脑损伤的重要手段。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述 Ephrin-B2配体在中枢神经系统的研究进展

致谢

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