关节软骨损伤生物标志物的蛋白质组学初步研究

摘要

目的:改良的Hulth造模方式建立关节软骨损伤模型,观察软骨损伤的大体和微观状态下特点,采用蛋白质组学质谱:表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术筛选关节软骨损伤的血清、关节液生物标志物。
　　 方法:选取新西兰大白兔20只为软骨损伤模型组。软骨损伤模型组:无菌条件下,沿兔膝关节内侧行纵型切口,长约4 cm,暴露膝关节,切断前后交叉韧带及内侧副韧带,完整切除内外侧半月板,保留关节软骨面。术后自由活动,不固定伤肢。30 min/d分2次驱赶,连续10周。以不做任何处理15只兔膝关节为正常对照。造模后4,8,10周时做Mankin评分、大体外观及电镜、光镜观察关节软骨的病理特点,并以X线检查关节软骨损伤情况。同时软骨损伤模型组和正常对照组兔处死,抽取血清、关节液,4℃室温条件下静置1h,然后4℃室温条件下离心10 min,速度:血清调整为3000r/min,关节液1000 r/min,吸取血清、关节液30ul,分装0.5mlEP管中,置于-80℃冰箱保存。用金属离子交换芯片(IMAC3-Cu)和弱阳离子交换芯片(CM10)结合表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术分析关节软骨损伤后血清、关节液中蛋白质谱的改变,寻找到关节软骨损伤的生物标志物。
　　 结果:
　　 1 关节软骨损伤模型的建立及各期生物学的特点:(1)正常对照组,大体组织学观察,关节面光滑平整,光泽明亮,无裂纹及软化灶;关节边缘齐整规则,无骨赘形成;HE图片显示成熟软骨细胞核小而圆,可见1～2个核仁,胞质弱嗜碱性,大小分布均匀,软骨周边部分为幼稚软骨细胞,较小,呈扁圆形,常呈单个分布。越靠近软骨中央,细胞越成熟,体积逐渐增大,变成圆形或椭圆形;电镜超微结构,软骨细胞和细胞核为椭圆形或近圆形的盘状结构,细胞表面有突起和皱褶,细胞核较大。胞质内可见丰富的粗面内质网和高尔基复合体,线粒体较少,细胞基质为半透明的环形带,基质中胶原纤维细而密,呈交织状,证明软骨细胞具有分泌软骨基质的能力;Mankin评分为O分,放射X线示关节间隙正常,无骨刺、骨赘生成,关节面平滑,未见明显异常。(2)建模4周时改变:与正常对照组相比,大体外观可见早期关节软骨病变:表现为关节软骨外观透明,色泽暗淡发黄;关节面轻度粗糙,有糜烂、软化灶;有少量滑膜充血增生,关节液增多;HE染色软骨表层不平整,层次出现不连续,软骨基质遭受破坏,基质轻染,出现纤维化,未伤及软骨下层:细胞轻度肥大增生,细胞核深染、变大,有软骨陷窝吸收现象,可见部分坏死软骨细胞;Mankin评分为3分,透射电镜微观显示:细胞表面突起和皱褶未减少,细胞核增大。胞质内的粗面内质网和高尔基复合体、线粒体增多,细胞基质为透明的环形带,表明软骨细胞分泌软骨基质的能力增强,代谢活动增大;放射X线观察未见明显异常。(3)建模8周改变:大体外观可见关节软骨中期改变,表现为关节软骨外观色泽暗淡灰黄;关节面粗糙,表面糜烂、软化灶;有滑膜充血增生,关节液增多,颜色浑浊,关节边缘尚齐整规则,有较小骨赘形成,个别裂隙可达到软骨下层;HE染色软骨组织层次不清,软骨细胞排列紊乱,出现纤维化,软骨细胞中度肥大增生,细胞核深染、变大,出现一胞多核,基质中度轻染;透射电镜微观显示软骨细胞表面突起和皱褶减少、模糊,胞核有突起,呈多角形。胞质内的粗面内质网和高尔基复合体、线粒体增多,细胞基质透明度增加,表明软骨细胞仍有代偿性分泌活动;Mankin评分为7分,放射X线观察可见骨性关节面局部消失,关节骨质结构发生改变,关节间隙狭窄,关节边缘有骨赘生成,关节面粗糙,有唇样变,关节间隙有游离体。(4)建模10周改变:大体外观可见关节软骨损伤晚期改变,表现为滑膜结节样改变,骨赘增生,滑液少而浑浊,软骨下骨暴露、皴裂;HE染色软骨细缺失,出现细胞空泡,肥大细胞,凋亡细胞,基质染色重度减少;透射电镜微观显示软骨细胞及其细胞表面突起消失,细胞外形不规则,细胞中度皱缩,细胞核界限不清:Mankin评分为10分,放射X线观察可见明显关节软骨损伤,关节骨质结构改变,关节间隙进一步狭窄,出现虫蚀样变化,关节面粗糙,骨质改变,关节边缘尖锐,有骨刺、骨赘形成。
　　 2 弱阳离子交换芯片(CM10)中的差异蛋白:(1)血清学样本:共获67个血清蛋白质峰,18个具统计学意义(P＜0.01),其中质核比为3475,6615,7558,16884,33665蛋白质谱波峰差异显著;(2)关节液样本:获得104个关节液蛋白质峰,10个具有统计学意义(P＜0.05),其中质核比为3475,3950,7558,16884,33175蛋白质谱波峰差异显著,且3475,7558,16884Da为血清学和关节液样本共有差异蛋白质谱波峰蛋白。
　　 结论:
　　 1 本实验采用改良的Hulth方法建立了兔关节软骨损伤模型,验证了其可行性、操作性,及其优缺点,并依据关节软骨损伤的早期、中期、晚期临床病理特点进行实验分组,从其大体组织学特点和光镜、电镜下软骨组织、软骨细胞的病理学特点的改变,进行了系统的研究。证明该模型能够较为全面系统的反应关节软骨损伤早期关节软骨代偿性增生、中期软骨逐步蜕变、晚期软骨损伤进行性加剧,出现不可逆病理损伤各期病理改变全过程。
　　 2 本实验同时采用Mankin评分表,验证了关节软骨损伤模型的早、中、晚各期的评分值,这对以后骨性关节炎各个不同时期的研究提供了实验理论基础。动物模型不同时间段的放射X线结果,进一步证明了目前放射学技术对关节软骨损伤发现诊断的延迟滞后性,说明研究关节软骨损伤生物标志物的必要性。
　　 3 与正常对照组相比,关节软骨损伤后在动物组织内血清和关节液的蛋白质表达谱出现变化。提示血清、关节液中出现的部分蛋白质:质核比3475,7558,16884Da可能为关节软骨损伤的生物标志物。
　　 4 动物关节液蛋白质表达谱和动物血清蛋白质表达谱不同,可能因为膝关节与血液循环通路之间的生物屏障和生物免疫应答基质及关节软骨修复代偿基质有联系。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 关节软骨损伤模型构建及其生物学的特点

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 应用SELDI-TOF-MS技术检测关节软骨损伤生物标志物血清、关节液蛋白表达谱

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 膝关节软骨损伤的研究现状及进展

致谢

个人简历