含LacZ基因重组腺病毒的制备及其在大鼠脊髓中的表达

摘要

目的:神经损伤后的修复仍然是困扰着神经科学基础与临床的一道难关。但由于其自身结构及再生特点,仅依靠外科手术修复断裂神经,其远期结构和功能恢复,尤其是运动功能的恢复难以获得满意的效果。在治疗外周神经损伤的各种方法中,基因治疗的研究进展尤为受到重视。周围神经损伤基因治疗是指通过某种方法、途径将目的基因导入人体细胞,使其在体内发挥作用,以达到基因治疗的目的,这不仅包括对中枢神经元的保护作用,还要能促进损伤神经的修复。其中腺病毒载体在神经再生、神经肌肉疾病以及神经示踪等基因治疗的实验研究方面已经表现出了多方面的优势。腺病毒载体是目前使用最多的病毒载体之一,其常用于表达外源性蛋白,是很好的表达重组抗原的载体系统。其具有宿主范围广泛、基因转移效率高、重组病毒滴度相对较高、外源基因容量较大、所介导的外源性基因的表达水平高以及不会引起宿主细胞基因突变等优点,并且其表达的外源蛋白具有天然蛋白的特性。这些特点使腺病毒成为基因治疗的重要载体。重组腺病毒载体(Recombinant adenovirus,AdV)既能感染分裂期细胞,也能感染非分裂期细胞,且携带的外源基因可长期存在,稳定表达,因此被普遍用于将外源基因导入受体细胞,被认为是神经系统高效的基因转染载体。正因为其转染细胞的高效性、多样性及转染后的安全性等特点,AdV的应用为基因治疗外周神经损伤带来了希望。我们拟构建含LacZ基因的重组质粒,制备携带目的基因LacZ的病毒,并期望能进一步将此载体通过损伤的外周神经传至脊髓,观察其在靶神经元的表达及其产物对外周神经的标记进程,掌握转基因的表达规律和特点,从而为腺病毒介导神经营养因子治疗外周神经损伤提供依据。
　　 方法:
　　 1 将已经包装好的含有LacZ基因的腺病毒载体质粒在感受态细胞中扩增,从而得到足够转染计量的质粒。收集扩增质粒并于-20℃冻存待用。
　　 2 复苏HEK-293细胞,在5％CO2培养箱中37℃培养。培养时2-3天换液。每天观察细胞生长,当细胞密度接近50％时传代,注意早期传代细胞的冻存。
　　 3 扩增后的质粒使用脂质体2000转染试剂盒转染HEK-293细胞,包装带有LacZ基因的重组腺病毒,在-70℃和37℃温度下通过反复冻融提纯腺病毒。
　　 4 病毒扩增后在96孔板中感染培养好的HEK-293细胞,在显微镜下可观察到293细胞有明显的CPE现象,利用50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度。
　　 5 将制备好的腺病毒2ul导入大鼠脊髓腰膨大节段,7天后取材,切成40μm的连续横切片,37℃下温箱内0.1％X-gal染液染色4h,挑选有阳性反应的切片贴片、中性红复染、封片。
　　 结果:
　　 1 HEK-293细胞呈梭形,多触角,贴壁强度小,细胞之间通过触角相互连接,倾向于形成单层细胞。
　　 2 重组腺病毒转染HEK-293细胞3天后,经4％多聚甲醛液固定20分钟及0.1％X-gal溶液染色4小时,在光学显微镜下观察细胞蓝染情况,即检测到LacZ基因的表达,细胞表达出携带目的基因的腺病毒颗粒,对照组未发现细胞蓝染情况。
　　 3 脊髓横切片中,LacZ基因阳性表达的蓝染细胞多位于脊髓前角,以注射侧蓝染细胞数量为多。浓密的蓝染使阳性细胞的形态清晰,很容易辨认出这些细胞是脊髓前角运动神经元和周围的胶质细胞。
　　 结论:
　　 1 保持HEK-293细胞在最适宜生长条件,有助于质粒的转染及病毒的成功制备。
　　 2 转染后反复冻融提纯病毒,重复感染293细胞,在排除其他感染的情况下细胞死亡,初步证明腺病毒能在细胞内稳定表达,为进一步实验开辟了道路。
　　 3 腺病毒介导的LacZ基因在大鼠脊髓中持续表达,为腺病毒介导神经营养因子治疗外周神经损伤提供依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 周围神经损伤修复治疗的研究进展

致谢

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