α-硫辛酸对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠线粒体损伤的保护作用

摘要

目的：多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病。以髓鞘脱失、神经胶质细胞增生、轴索变性和进行性神经功能障碍为主要特点，其确切的病因及发病机制尚不清楚。目前认为与环境因素、遗传易感、自身免疫等多种因素有关。
　　目前国内外研究表明：氧化应激在MS的发病中起了非常重要的作用。氧化应激反应产生氧自由基和其他代谢产物，诱发自由基链式反应、产生大量脂质过氧化物、损伤生物膜破坏亚细胞结构、导致酶活性降低或消失、细胞自溶。
　　相关国外的研究指出：线粒体的结构和功能的损伤是由线粒体相关蛋白的失活及氧化应激所介导的，而线粒体的功能障碍导致编程性细胞死亡，最终造成多发性硬化的实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型中轴索和神经元的变性。同时认为线粒体形态和功能的损害在病程早期就开始发生，线粒体损伤的程度与病情的严重程度密切相关。线粒体损害越重，MS的预后越差。
　　α-硫辛酸属于维生素B类化合物，是一种天然抗氧化剂。它主要通过清除自由基，螯合金属离子，再生其他抗氧化剂而发挥抗氧化作用。在国外，α-硫辛酸通过干预氧化应激过程，减少自由基对血管和神经的损伤作用而被用于治疗糖尿病周围神经病变并且已取得了较好的疗效。但目前国内外对于α-硫辛酸用于多发性硬化的研究很少，关于α-硫辛酸对MS线粒体结构和功能损伤是否具有保护作用，尚不清楚。
　　本实验通过建立多发性硬化模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，对EAE大鼠发病过程中线粒体的超微结构和Na+/K+ATP酶的测定及分析，进一步了解MS发病过程中线粒体损伤情况。通过α-硫辛酸对EAE大鼠的干预来观察这些指标的相应变化，了解其对线粒体损伤是否具有保护作用，从而为临床上治疗MS提供新的思路和相关的实验依据。
　　方法：
　　将70只成年健康雌性Wistar大鼠，体重180～200 g，随机分出正常对照组(NC组)8只，用完全弗氏佐剂加生理盐水注射动物。其余62只用新鲜豚鼠全脊髓匀浆(GPSCH)诱导免疫，待动物第一次发病后随机选6只为发病组(DIS组)，其余随机分为EAE组、硫辛酸组(LA组，100mg/kg.d)和地塞米松组(DXM组，2mg/kg.d)。每组再按病程平均分为缓解组(REM组)，复发组(REL组)。药物干预组动物无复发者，按预实验中统计的EAE组动物缓解复发平均天数分为干预后7天组(LA7组：DXM7d组)和干预后14天(LA14d组；DXM14d组)。每天称量体重和作神经功能评分，按照时间点处死老鼠后，取脑组织行HE染色观察炎性细胞的浸润，在电镜下观察超微结构；取脑组织制成匀浆样品，提取线粒体，应用考马斯亮蓝法测蛋白含量，化学比色法测定Na+/K+ATP酶含量。
　　结果：
　　1动物发病及复发情况观察：EAE大鼠大多数在免疫后的第11天开始出现临床症状，多在第14天达到临床高峰，之后逐渐缓解。对照组无发病。LA组、DXM组复发率均小于EAE组，有统计学意义(P<0.05)。LA组与DXM组之间无统计学意义(P>0.05)。
　　2神经功能评分：缓解期和复发期：LA组、DXM组评分均小于EAE组，有统计学意义(P<0.05)，LA组与DXM组之间评分比较无统计学意义(P>0.05)。
　　3组织病理学观察：
　　3.1 HE染色：
　　各组大鼠的脑组织内都可见不同程度的炎性细胞浸润，尤其以发病组大鼠的脑组织内炎性细胞浸润的程度最为显著，在血管周围出现密集的袖套样炎性细胞浸润。干预组大鼠的中枢神经组织内炎性细胞浸润程度较轻。
　　3.2电镜观察：
　　发病期病理改变以髓鞘损伤为主，髓鞘板层疏松、脱失，轴突肿胀、疏松，线粒体肿胀、空泡化、嵴溶解；缓解期，同时出现结构受损的髓鞘和结构相对完整的髓鞘，且轴突内的超微结构模糊，线粒体也可见空泡化、嵴稀疏；复发期，轴突受损更严重，出现空泡变甚至轴突消失，线粒体的肿胀、空泡化及线粒体嵴溶解也更严重。各干预组也可见到上述改变，但其程度相对较轻。
　　4 Na+/K+ATP酶的测定
　　结果显示：正常组Na+/K+ATP酶含量最多；发病期Na+/K+ATP酶含量减少，缓解期含量有所增加，复发期含量再次减少；经DXM和LA药物干预后Na+/K+ATP酶含量有所增加。
　　结论：
　　1 EAE大鼠中枢组织中存在线粒体结构和功能的变化，Na+/K+ATP酶的含量与病情活动性相关，随病程发展呈一定的变化趋势，药物干预对各指标有一定影响。
　　2硫辛酸可以促进EAE大鼠的病情缓解，降低动物复发率。
　　3硫辛酸对EAE大鼠线粒体功能有一定保护作用，其保护作用可能通过抗氧化应激作用来实现。保护