二甲双胍诱导大鼠子宫内膜异位症模型调亡的研究

摘要

目的：子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)是一种多发在育龄妇女的常见病，其治疗方法主要有药物治疗，手术治疗。由于手术治疗易出现绝经症状及复发率较高，对于育龄期妇女不易接受。目前EMs中药和西药治疗成为该疾病的治疗热点。但是因其发病机制目前尚未完全明确，而缺少有效的治疗方法。近年EMs发病主导理论Sampson理论得到了补充和修正，提出逆流的子宫内膜需经粘附、侵袭和血管形成(即“3 A”模式)方可发病，决定EMs是否发生的关键是子宫内膜本身，即“在位内膜决定论”。研究发现，子宫内膜细胞凋亡是内膜组织保持正常结构和功能的关键前提，EMs内膜细胞抗凋亡活性增加和促凋亡活性减低，逃避了机体免疫清除，从而使异位内膜细胞在宫腔外种植、存活及生长，因此说明子宫内膜细胞凋亡异常促进EMs的发生及发展。
　　二甲双胍(Metformin，Met)作为2型糖尿病(Diabetes mellitus，DM)的一线用药已有50多年，最近研究表明，二甲双胍通过激活AMPK信号途径对不同类型的腺上皮癌有显著的抗增殖和促凋亡的作用如卵巢上皮腺癌和子宫内膜癌。二甲双胍可以抑制子宫内膜基质细胞增值及国外研究表明二甲双胍对大鼠子宫内膜异位症模型治疗的有效性。基于以上研究本研究利用SD大鼠建立子宫内膜异位症模型，验证二甲双胍对子宫内膜异位症的有效性。
　　研究表明抑凋亡Bcl-2基因蛋白在EMs患者的异位及在位内膜组织中的表达均明显高于正常子宫内膜中的表达。凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax和P53蛋白在EMs的发生发展中起着至关重要的作用，所以凋亡调控基因Bcl-2/Bax和P53的可能成为EMs的治疗靶点；基于以上研究和在子宫内膜转移、侵袭、血管形成中凋亡起着非常重要的作用，因此本实验进一步研究二甲双胍是否通过调节凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax和P53，诱导凋亡，成为治疗EMs的有效措施并探讨相关的分子机制。为EMs的临床治疗提供新的策略和靶点。
　　方法：采用非动情期自体内膜移植法建立SD大鼠子宫内膜异位症模型。55只大鼠中因肠梗阻死亡5只，有44只大鼠造模成功，其中有40只符合纳入标准(囊泡高度>2mm)，选取2只成模大鼠的异位内膜组织，进行组织病理学观察。将剩余38只大鼠进行数字表法随机分为A，B，C，D组，GroupA50mg·kg-1·d-1，GroupB100mg·kg-1·d-1和GroupC200mg·kg-1·d-1二甲双胍组(各10只)，GroupD(8只)生理盐水对照组。连续每天同时给药共28天后，收集标本进行指标测定。
　　1测量用药前后内异灶体积；统计分析用药前后内异灶体积差异及用药前后内异灶体积变化。
　　2 HE染色进行大鼠在位内膜和异位子宫内膜病理形态学观察。
　　3采用TUNEL法检测在位内膜和异位内膜细胞凋亡情况，用凋亡指数进行表示。
　　4采用SABC法免疫组化法测定异位子宫内膜组织中Bcl-2、Bax和P53蛋白表达情况。
　　5采用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测异位内膜组织中Bcl-2、Bax和P53mRNA基因转录水平。
　　6采用Western immunoblotting法检测异位内膜组织中磷酸化AMPK(P-AMPK)和磷酸化mTOR(P-mTOR)蛋白的表达情况。
　　7应用流式细胞仪分析异位内膜细胞周期的的分布情况。
　　8采用Pearson相关分析P-AMPK活性和G1细胞比例的相关性。
　　9实验数据均用X±s表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。符合正态方差齐的多组计量资料比较进行单因素方差分析及SNK-q多重检验；不符合正态或/和方差不齐的多组比较采用Kruskal-Wills H秩和检验及Mann-Whitney U多重检验。P≤0.05为差异有显著性。
　　结果：
　　1成功建立SD大鼠子宫内膜异位症模型，成模率为80％。
　　2用药前各组内异灶体积差异均无显著性(P>0.05)；用药后二甲双胍各组内异灶体积均缩小，与对照组相比，各组内异灶平均体积均小于对照组(P<0.05)；二甲双胍各组内异灶平均体积两两比较均无统计学差异(P>0.05)；100mg·kg-1·d-1二甲双胍组体积减小更明显。
　　3 HE染色镜下观察，A，B，C二甲双胍组可见异位内膜萎缩，较对照D组腺体数目减少、腺腔较小，腺上皮细胞呈扁平或矮立方形，有的腺体消失，间质细胞较小；A，B，C各组在位内膜较对照D组腺体数目减少，腺上皮呈柱状或立方形，间质细胞较密。
　　4 TUNEL法检测在位内膜：A、B、C二甲双胍组的凋亡指数分别为(15.29±0.035)％、(29.65±0.259)％、(25.96±0.178)％，与对照D组(7.14±0.052)％相比均增高(P<0.05)。其中100mg·kg-1·d-1二甲双胍组增加凋亡指数的效果最明显(P<0.05)；大鼠内异灶：A、B、C二甲双胍组的凋亡指数分别为(26.07±0.155)％、(29.65±0.259)％、(28.37±0.105)％，与对照D组(7.14±0.052)％相比均增高(P<0.05)。其中100mg·kg-1·d-1二甲双胍组增加凋亡指数的效果最明显(P<0.05)。
　　5 SABC免疫组化法测定大鼠子宫异位内膜中Bcl-2、Bax和突变P53蛋白表达，与对照组相比，二甲双胍各组Bcl-2和突变P53蛋白表达均降低，而Bax蛋白表达均增强，两者均具有统计学意义(P<0.05)。
　　6 RT-PCR检测二甲双胍对大鼠异位灶Bcl-2、Bax和P53 m RNA转录的影响，与对照组相比，二甲双胍各组Bcl-2 mRNA基因转录均降低(P<0.001)；而二甲双胍各组Bax和P53 mRNA的基因转录水平显著高于对照组，并呈现剂量依赖性(P<0.001)。
　　7 Western immunoblotting检测二甲双胍对大鼠内异灶P-AMPK和P-mTOR蛋白表达的影响，二甲双胍各组P-AMPK蛋白表达均有增高趋势，而P-mTOR蛋白表达均有降低趋势，与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。100mg·kg-1·d-1二甲双胍组增加P-AMPK蛋白表达和降低P-mTOR蛋白表达的效果更显著(P<0.05)。
　　8流式细胞分析二甲双胍对大鼠异位内膜细胞周期分布的影响，二甲双胍各组异位内膜细胞G0/G1期比例分别为：A组(71.66±0.526)％、B组(79.48±0.465)％、C组(71.01±0.387)％明显高于对照D组(58.66±0.358)％，差异均具有统计学意义(P<0.05)；其中二甲双胍100mg·kg-1·d-1组异位内膜细胞G0/G1期比例最高(P<0.05)。
　　9二甲双胍激活异位子宫内膜P-AMPK活性与细胞阻滞在G1期呈正相关关系(r=0.95，P=0.05)。
　　结论：二甲双胍通过缩小大鼠内异灶的体积证实对EMs治疗的有效性；二甲双胍可能通过激活AMPK信号途径，调节凋亡调控基因Bcl-2、Bax和P53的表达诱导细胞凋亡，还可将异位子宫内膜细胞阻滞在G1期，从而抑制内异灶的进展。