丁苯酞对缺氧致PC12细胞损伤保护作用的比较蛋白质组研究

摘要

目的:缺血性卒中是最常见的一种脑血管疾病,死亡率和致残率均较高,严重危害人类的健康和生活质量。其病理机制在于,供应脑部血液的颅外或颅内动脉发生闭塞性病变,使局部脑组织的代谢需求与血液供应之间发生不匹配所致脑组织缺血缺氧的一系列病理变化,包括:细胞能量代谢异常、酸中毒、钙失稳态、自由基毒性、炎症反应等。丁苯酞可增加缺血区脑血流量,改善全脑缺血后脑的能量代谢和脑缺血区微循环,抑制炎症反应和钙内流,保护线粒体功能,减轻神经功能的损伤程度,缩小局灶性脑缺血后的梗死灶等,对缺血性卒中具有较佳的治疗保护作用。已有不少研究从不同角度对丁苯酞的作用机制进行了阐述,但目前尚未见到蛋白质组学层面的研究。系统了解药物治疗过程中特异的蛋白质变化将促进个体化的药物治疗的发展。这种变化能够被基于二维凝胶电泳和基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱的蛋白质组学方法所鉴定。蛋白质组学技术已经成为生命科学领域极其活跃的学科。比较蛋白质组学用于分析不同条件下蛋白质组的变化和差异,发现和鉴定不同生理状态下蛋白质组的差异,可在蛋白质水平提供关于疾病发生和细胞代谢等过程的整体而全面的认识。随着蛋白质组学技术和方法不断发展,将在药物作用靶点的发现、确认和药物多靶点研究等方面起到重要的作用,并将大大提高药物发现的效率。PC12细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系,在形态、生理、生化等方面接近神经元,同时具有神经内分泌细胞和神经元的特性,经常被用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害的研究。本研究通过比较蛋白质组学技术对拟缺血损伤PC12细胞以及丁苯肽干预的PC12细胞进行研究,分离、鉴定差异表达蛋白,以期深入理解缺血性脑血管病发病机制及丁苯酞药物作用分子机制。
　　 方法:1.制作缺氧细胞模型。利用含二亚硫酸钠(Na2S2O4)的无血清培养基处理PC12细胞,建立细胞缺氧模型。2.丁苯肽作用于缺氧损伤的PC12细胞。MTT代谢率测定PC12细胞活性。观察丁苯肽对Na252O4导致的PC12细胞缺氧损伤的保护作用。3.细胞蛋白提取,并进行第一向等电聚焦电泳、第二向垂直SDS-PAGE电泳后、以考马斯亮兰R250显色。透射扫描双向电泳凝胶,所得图谱以ImageMaster2DElite软件进行图像分析。将感兴趣蛋白质点从考马斯亮兰染色的凝胶上切下,胶内蛋白质酶解。以MALDI-TOF/TOF串联质谱技术结合数据库检索对蛋白质进行鉴定。
　　 结果:
　　 1、不同浓度的Na2S2O4对PC12细胞存活率的影响
　　 加入不同浓度的Na2S2O4后,PC12细胞的生长受到不同程度的抑制,细胞胞膜缺损,胞体萎缩、脱落,细胞聚集。随着浓度Na2S2O4的增大,细胞平均吸光度值逐渐降低。当Na2S2O4浓度大于等于5mmol/L时,吸光度值与对照组有明显差异(P＜0.01)。
　　 2、丁苯酞对Na2S2O4损伤的PC12细胞的保护作用
　　 给予5mmol/L Na2S2O4,同时给予不同剂量的丁苯酞,随着丁苯酞浓度的增大,细胞平均吸光度值逐渐增加。当丁苯酞浓度大于等于10μmol/L时,吸光度值与模型组有明显差异(P＜0.01)。
　　 3、缺氧模型组与丁苯酞干预组PC12细胞双向电泳图谱比较
　　 缺氧模型组与丁苯酞干预组(NBP10μ mol/L)PC12细胞双向电泳蛋白质点定量比较,鉴定出21种差异蛋白,其中上调15种,下调6种。
　　 4、质谱分析及鉴定结果
　　 21种差异表达电白鉴定结果,上调蛋白为:ATP合酶β亚基(1-3蛋白点)、肌动蛋白、热休克同源蛋白71、细胞周期G相关蛋白激酶、膜联蛋白A6、外周蛋白、假定蛋白、延伸因子1-γ、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A调节亚基B、过氧化物酶-2、TREA、泛素C末端水解酶L1,下调蛋白为:V型质子泵ATP酶B亚基、Phosphoribosylformylglycinamidine Synthas、低氧上调蛋白-1、Pirin、二甲基精氨酸-二甲胺水解酶2、热休克蛋白β1。
　　 结论:
　　 1、利用含二亚硫酸钠的无血清培养基处理PC12细胞,成功建立细胞缺氧模型。通过丁苯肽处理后缺氧损伤的PC12细胞MTT代谢率的观察,测定PC12细胞活性,提示丁苯酞对缺血性脑损伤发挥有效地神经保护作用。
　　 2、本实验鉴定的21种差异表达蛋白涉及多种蛋白种类,包括代谢酶类、具有分子伴侣活性的蛋白、信号转导蛋白、细胞骨架相关蛋白等,进一步深入研究分析这些蛋白质,对于更全面深入地理解丁苯酞对缺血缺氧神经元保护作用的作用机制有重要意义。