脐带源间充质干细胞在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的肝细胞样分化作用

摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝脏对各种不同致病因子引起的慢性炎症、坏死或其他损伤的修复反应，肝硬化则是肝纤维化的终末阶段。此时，肝炎病毒、酒精代谢产物、胆汁酸等肝脏毒性物质作用于肝细胞，肝功能明显下降，同时受损肝细胞释放的AST、ALT、TBIL、DBIL、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和纤维形成介质导致自身凋亡。目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效方法，但由于肝源紧张、免疫排斥等原因限制了肝移植的临床应用。因此亟待寻找新的有效治疗方法。
　　细胞治疗是指有活性的细胞替代、修复损伤的组织，进而使组织器官恢复其功能的有效治疗方法。近年来细胞治疗已成为替代器官移植的有效治疗方法。其中干细胞治疗肝硬化等终末期肝病的疗效已得到证实。
　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，广泛存在于骨髓、脐带组织、脐血、外周血及脂肪等组织中，在特定条件下，可以分化为骨细胞、神经细胞、肝细胞等多种细胞。MSCs易于提取，低免疫原性，并且具有免疫抑制作用，避免了肝移植的肝源紧张、移植后免疫排斥等不足，被认为是目前最具治疗潜力的供体细胞。有研究证实骨髓源间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BM-MSCs)可以分化为功能性肝细胞，修复损伤的肝组织，从而改善肝纤维化和肝硬化；另有研究发现脂肪源MSCs(adiposetissue-derived mesenchymal stem cells，AT-MSCs)在体外向肝细胞分化过程中经历了间充质细胞向上皮细胞的转变(mesenchymal-to-epithelialtransition，MET)。关于MSCs在体内的动态分化过程及在此分化过程中是否经历了MET尚不清楚。为此，我们构建大鼠肝纤维化及肝硬化模型，经尾静脉注射人脐带源MSCs(human umbilical cord-derived mesenchymalstem cells，hUC-MSCs)，观察hUC-MSCs对肝纤维化、肝硬化的治疗作用，在体内的动态分化过程及分化的具体机制，为hUC-MSCs治疗肝纤维化及肝硬化提供理论依据。
　　目的：研究hUC-MSCs在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的动态分化过程及其分化机制。
　　方法：将健康成年雄性Wistar大鼠分为对照组(正常大鼠，CCl4/saline0 wk，8只)，模型组(肝纤维化模型组：CCl4/saline4 wks，5 wks，7 wks；肝硬化模型组：CCl4/saline8 wks，10 wks，14 wks；每组8只)，MSCs移植组(肝纤维化MSCs移植组：CCl4/MSCs0 wk，1 wk，2 wks，4 wks；肝硬化MSCs移植组；CCl4/MSCs0 wk，2 wks，4 wks，8 wks；每组8只)。采用浓度40％CCl4橄榄油溶液，按2 ml/kg体重的剂量，给予四肢轮流皮下注射，每周2次；造模成功后模型组及治疗组继续每周2次皮下注射CCl4，直至处死。肝纤维化及肝硬化MSCs移植组分别于造模成功后(即CCl4注射第4周和第7周)经尾静脉注射hUC-MSCs，剂量为5×106个/只，并分别于注射后1、2、4周和2、4、8周处死大鼠。
　　应用血清学检测方法检测大鼠ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL，观察hUC-MSCs移植对大鼠肝功能的影响；采用Haematoxylin and eosinstaining(H&E染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)和天狼猩红染色法检测肝组织病理改变；采用免疫荧光染色、Western blot和real-timeQ-PCR方法检测各组大鼠肝脏组织中人来源的ALB、AFP蛋白和mRNA的表达，免疫组织化学染色、Western blot和Real time-PCR方法检测人来源的CK18、CK19、vimentin、α-catenin、E-cadherin蛋白和mRNA在大鼠肝组织中的表达，采用Real time-PCR方法检测人来源的N-cadherin。
　　结果：QH&E、MT及天狼猩红染色结果显示：CCl4诱导的大鼠肝纤维化和肝硬化模型成功建立，模型组随给药时间的延长，肝细胞变性坏死及肝内纤维组织沉积逐渐增多；与模型组相比，MSCs移植组肝细胞变性坏死有所减少，HE炎症评分、纤维化程度分级及纤维组织沉积定量分析结果显示：与模型组相比，除肝纤维化MSCs移植CCl4/MSCs1 wk组与肝纤维化模型CCl4/saline4 wks组相比无明显差异外，肝纤维化CCl4/MSCs2 wks组、4 wks组及肝硬化MSCs移植各组均显示存在显著性差异；②血清学检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组模型中，CCl4/MSCs1wk组肝功能较CCl4/saline4wks组无明显改善，在CCl4/MSCs2 wks组中，ALT、AST较CCl4/saline5wks组中的显著降低，ALB、TBIL、DBIL无明显改善；在肝硬化MSCs移植组模型中，CCl4/MSCs2 wks中的ALB较CCl4/saline8wks组无明显升高，其余各个时间点MSCs移植组较模型组的肝功能明显好转。③免疫荧光染色及免疫组织化学染色检测结果显示：肝纤维化MSCs移植组中，ALB、AFP、CK18、CK19、E-cadherin及α-catenin表达水平随移植时间的延长表达量逐渐升高，vimentin表达量随MSCs移植时间的延长其含量逐渐下降；在肝硬化MSCs移植组中，随MSCs移植时间的延长，ALB、CK18表达量逐渐增多，vimentin随移植时间的延长其含量逐渐下降，AFP、CK19、E-cadherin及α-catenin在移植后4周较2周组有所增加，移植后8周组较4周组下降，在MSCs移植前以上蛋白均无表达。④应用Western blot检测ALB、AFP、CK18、CK19在大鼠肝脏组织中的表达，在肝纤维化MSCs移植组，CCl4/MSCs2 wks组的ALB、CK18的蛋白表达水平与CCl4/MSCs1 wk组的无显著性差异，而CCl4/MSCs4 wks组的ALB、CK18的蛋白表达较CCl4/MSCs2 wks组的显著升高，随MSCs移植时间的延长，AFP、CK19的蛋白表达水平逐渐升高，以上4种蛋白在MSCs移植前均呈阴性表达；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl4/MSCs2 wks组相比，CCl4/MSCs4 wks组的AFP、CK19 mRNA表达显著升高，而CCl4/MSCs8 wks组的AFP、CK19 mRNA较CCl4/MSCs4 wks组显著下降，CK18、ALB的蛋白随MSCs移植时间的延长而表达增加，其上蛋白在MSCs移植前均为阴性表达。⑤应用real-time Q-PCR检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组中，CCl4/MSCs2 wks组的ALB、CK18 mRNA表达水平与CCl4/MSCs1 wk组中的无显著性差异；而CCl4/MSCs4 wks组的ALB、CK18 mRNA含量较CCl4/MSCs2 wks组的显著升高，随MSCs移植时间的延长，AFP、CK19的mRNA表达水平显著升高；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl4/MSCs2wks组相比，CCl4/MSCs4 wks组的AFP、CK19 mRNA表达显著升高，而CCl4/MSCs8 wks组中的AFP、CK19 mRNA表达含量较CCl4/MSCs4wks组的显著下降，CK18、ALB mRNA水平随移植时间的延长而表达显著增加，以上几个指标的mRNA在MSCs移植前均无表达。⑥Western blot检测结果显示，在肝纤维化MSCs移植组中，vimentin蛋白随MSCs移植时间的延长而表达下降，随MSCs移植时间的延长，E-cadherin及α-catenin的蛋白表达水平显著增加，以上蛋白在MSCs移植前均为阴性表达；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl4/MSCs2 wks组相比，CCl4/MSCs4 wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA表达显著升高，而CCl4/MSCs8 wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA较CCl4/MSCs4 wks组显著下降，随MSCs移植时间的延长，N-cadherin、vimentin mRNA表达水平显著下降，以上蛋白在MSCs移植前均无表达。⑦应用real-time Q-PCR检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组中，N-cadherin、vimentin mRNA随MSCs移植时间的延长而表达下降；随MSCs移植时间的延长，E-cadherin及α-catenin mRNA的表达显著增加；在肝硬化MSCs移植组，与CCl4/MSCs2 wks组相比，CCl4/MSCs4 wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA表达显著升高，而CCl4/MSCs8 wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA较CCl4/MSCs4 wks组的显著下降，随MSCs移植时间的延长，N-cadherin、vimentin mRNA表达水平显著下降，N-cadherin、vimentin、E-cadherin及α-catenin在MSCs移植前均无表达。
　　结论：hUC-MSCs移植对大鼠肝纤维化及肝硬化均具有治疗作用，hUC-MSCs分化为肝细胞样细胞是其治疗机制之一；hUC-MSCs在体内向肝细胞的转化是一个动态分化的过程，在此分化过程中hUC-MSCs经历了MET。