白芷香豆素类成分与其代谢物的体内外研究及溪黄草的排泄动力学

摘要

白芷为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根，为常用中药。中国药典(2010年版一部)记载其用于感冒头痛，眉棱骨痛，鼻塞流涕，鼻渊，牙痛，带下，疮疡肿痛。白芷中主要成分为香豆素类化合物。本研究采用液质联用(HPLC-MS)技术，测定了大鼠口服白芷提取物后尿样和胆汁中8种香豆素类化合物的含量，并应用于排泄研究。蛇床夫内酯是白芷药材中的主要成分之一，本实验室已通过微生物转化制备得到2种代谢物，采用液质联用技术通过测定2种代谢物的生成量，研究了蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学。另外，采用HPLC-MS技术鉴定了大鼠口服蛇床夫内酯后胆汁、尿液、粪便中的代谢物。
　　溪黄草为唇形科香茶菜属狭基线纹香茶菜Isodon serra(Maxim)Hara的干燥全草，用于治疗肠炎、黄疸、肝炎、胆囊炎、胆结石和代谢综合征等。本研究建立了LC-MS法同时测定大鼠尿液中12种二萜类成分，并用于排泄动力学研究。
　　第一部分 LC-MS法同时测定大鼠尿和胆汁中8种香豆素类成分及排泄动力学研究
　　目的：建立HPLC-MS法同时测定大鼠口服白芷提取物后尿液和胆汁中8种香豆素类化合物的含量，并应用于排泄研究。8种香豆素类化合物为佛手柑内酯、花椒毒素、花椒毒酚、异茴芹内酯、氧化前胡素、欧前胡素、蛇床夫内酯和异欧前胡素。
　　方法：液相色谱柱为Sapphire C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇：水(含有0.1％甲酸)，72:28等度洗脱。质谱采用电喷雾离子源(ESI源)，TurboV离子源，正离子模式，采用多反应监测模式(MRM)。内标为茴芹内酯。大鼠灌胃给予白芷提取物8 mL/kg，胆汁按照0-2，2-4，4-6，6-8，8-12，12-20，20-24 h收集，尿液按照0-4，4-8，8-12，12-24，24-30，30-36，36-48，48-60，60-72 h时间段收集。样品经乙酸乙酯液液萃取。
　　结果：8种香豆素类化合物的线性关系良好(r≥0.9932)，日内日间精密度均小于14.5％，相对误差RE均在±15％内。提取回收率均大于86.9％，基质效应的范围是86.8～110.0％，稳定性良好。8种香豆素类化合物在胆汁中24 h之内基本排泄完全，累积排泄百分数分别为0.045％，0.019%，0.177％，0.105％，0.337％，0.023％，0.024％，0.021％。在尿样中60h基本排泄完全，排泄百分数分别为1.78％，0.095％，0.130％，0.292％，0.082％，0.008％，0.005％，0.004％。
　　结论：该方法灵敏度高，选择性好，样品处理简单，可用于大鼠口服白芷提取物后胆汁和尿液中香豆素类化合物的排泄动力学研究。
　　第二部分蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究
　　目的：建立HPLC-MS法，测定蛇床夫内酯2个代谢物M1和M2(3”，8-甲氧基异欧前胡内酯和5”-羟基-8-甲氧基异欧前胡内酯)在大鼠肝微粒体中的生成量，研究其酶促反应动力学。
　　方法：色谱柱为Sapphire C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇：水(各含有0.05％甲酸)，质谱采用电喷雾离子源(ESI源)，正离子模式，采用多反应监测模式(MRM)。内标为茴芹内酯。根据文献方法将M1和M2加入肝微粒体温孵液中，振荡一段时间。得最佳温孵时间、蛋白浓度以及底物浓度。双倒数作图法作图得回归方程，计算Vmax、Km和CLmin。
　　结果：方法学考察结果良好，最佳温孵时间为30 min，蛋白浓度为1mg·mL-1，底物浓度为46.35μmol·L-1。M1：Vmax=1.152μmol·(min·mgprotein)-1，Km=133.2μmol·L-1，CLmin=8.655 mL·(min·mg protein)-1。M2：Vmax=1.63μmol·(min·mg protein)-1，Km=292.9μmol·L-1，CLmin=5.569mL·(min·mg protein)-1。
　　结论：该方法简单、成熟、可靠，得到最佳反应条件和酶促动力学参数，可用于蛇床夫内酯的体外代谢研究。
　　第三部分蛇床夫内酯在大鼠体内的代谢研究
　　目的：建立HPLC-MS方法，分离筛选蛇床夫内酯在大鼠胆汁、尿液和粪便中产生的代谢产物。
　　方法：色谱柱为Sapphire C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇：水(含有1 mmol/L的醋酸铵)，梯度洗脱，质谱采用电喷雾离子源(ESI源)。大鼠灌胃给予蛇床夫内酯，收集胆汁、尿液、粪便。联合母离子扫描-信息依赖-增强型子离子扫描(PREC-IDA-EPI)和多反应监测-信息依赖-增强型子离子扫描(MRM-IDA-EPI)模式分析鉴定蛇床夫内酯的代谢产物。
　　结果：根据香豆素类化合物的裂解规律，与对照品比对，在大鼠体内鉴定出蛇床夫内酯的18种代谢物。其中胆汁中发现了14个代谢物，尿液中发现了9个代谢物，粪便中发现了10个代谢物。
　　结论：本文建立了快速、准确的方法，鉴定了大鼠胆汁、尿液、粪便中蛇床夫内酯的18种代谢产物。
　　第四部分 LC-MS法同时测定大鼠尿液中溪黄草12种二萜类成分及排泄动力学研究
　　目的：建立HPLC-MS法同时测定大鼠口服溪黄草提取物后尿液中12种二萜类化合物的含量，进行排泄动力学研究。
　　方法：色谱柱为Sapphire C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇：水(各含有0.01％甲酸)，梯度洗脱，质谱采用电喷雾离子源(ESI源)，正负离子同时监测，采用多反应监测模式(MRM)。内标为磺胺甲噁唑(SMZ)。大鼠灌胃给予溪黄草提取物8 mL/kg，收集0-4，4-8，8-12，12-24，24-30，30-36，36-48，48-60，60-72，72-84，84-96 h尿液，样品经乙酸乙酯液液萃取。
　　结果：12种二萜类化合物线性关系良好(r≥0.9923)，日内日间精密度均小于10.8％，相对误差RE均在±15％内。提取回收率均大于88.1％，基质效应的范围是80.0～94.3％，稳定性良好。12种分析物在尿样中96 h基本排泄完全，排泄百分数分别为0.44％，1.73％，0.34％，5.71％，1.72％，0.11％，0.57％，1.13％，2.83％，4.74％，0.027％，0.43％。
　　结论：本研究首次采用HPLC-MS法测定了大鼠尿液中溪黄草12种二萜类成分，并研究了其排泄动力学。方法准确，结果可靠，可满足中药材在生物基质中的排泄研究。