基于无监督数据挖掘技术的中风病用药规律及处方发现研究

摘要

目的：本研究广泛搜集古今中风病治疗文献，运用现代计算机技术与统计学相结合的方法，通过建立中风病方药数据库，运用频数、图表等数理分析方法进行研究，归纳、总结出历代医家对中风病的证治规律和用药特点的总体认识，并在分析中风病处方用药规律的基础上，应用无监督数据挖掘技术挖掘中风病常见证型的新处方进而运用实验验证其有效性，为发现新的中风病复方药物开辟新途径。通过研究建立以数据挖掘与中医文献分析相结合的复方中药研发模式。
　　方法：
　　1古今文献中风病用药规律研究
　　1.1中风病文献数据库的建立
　　广泛搜集古今中风病治疗文献，整理出符合文献纳入标准的文献记录855首，对其症状、中药名等进行规范化处理，核对并录入Epidata3.1软件，把数据转化为符合数据挖掘和统计分析要求的SPSS18.0数据库，进行下一步数据库分析。
　　1.2各历史时期中风病用药规律研究
　　应用计算机统计软件SPSS18.0采用频数分析法对中风病药物使用频率、药物属类百分比等进行比较分析，从而统计出高频次的药物和高使用率的药物属类，进而推论出该病在不同历史时期的用药规律和主导趋势。采用柱状图表分析方法横向对比同朝代各类药物味数及占所有药物百分比，简要分析同时期中风病用药规律；纵向对比不同朝代的常用药类，把握历史中风病用药规律。
　　2无监督数据挖掘技术的中风病新处方发现研究
　　从中风病文献总数据库855首方药中分别筛选出气虚血瘀证、风痰阻络证、痰热内闭证、阴虚风动证四个证型的方药。各证型筛选出的方药分别录入SPSS18.0软件后应用中国科学院自动化研究所陈建新博士设计的非监督模式发现分析软件进行数据处理。应用改进的互信息法[1]、复杂系统熵聚类方法[2-3]对药物进行关联度分析，分别得出各证型的常用药对和核心组合，对药对、核心组合经验配伍，得出各证型的3个新处方，经中医专家研究探讨，认定新处方基本符合中风病各证型的临床用药配伍规律。
　　3无监督数据挖掘技术得出的中风病气虚血瘀证型新处方--参龙活血方对实验性脑缺血大鼠行为学、脑梗死面积和组织形态的影响
　　健康清洁级雌雄各半SD大鼠，随机分为五组：假手术组、模型组、参龙活血方大剂量组(3.424g/kg·d)、参龙活血方小剂量组(1.712g/kg·d)、尼莫地平组(10mg/kg·d)。采用三氯化铁贴敷法阻断大鼠一侧大脑中动脉制作局灶性脑缺血大鼠模型，假手术组大鼠只挑开脑膜，不贴敷三氯化铁。各用药组均在大鼠造模前7d灌胃，假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，各组分别于缺血后6h和7d分批处死部分动物(n=6)。通过横木行走试验、肌力测试试验、错步试验进行神经行为学评分，HE染色观察组织形态学改变，脑缺血后7dTTC染色测定脑梗死面积变化。
　　4参龙活血方对实验性脑缺血大鼠血脑屏障通透性的影响及保护作用机制的研究
　　实验造模及分组、给药方法同3，各组大鼠于脑缺血后6h、7d，腹腔取血，分离血清，进行血清IL-1β、IL-10、SOD和MDA水平检测；于脑缺血后6h运用伊文思蓝法检测各组大鼠血脑屏障通透性；于脑缺血后6h、7d透射电镜观察血脑屏障的超微结构的变化；应用SP免疫组织化学方法和RT-PCR法检测各组大鼠脑组织中紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的分布和表达水平及其mRNA的表达水平的变化。
　　结果：
　　1各历史时期中风病用药规律研究
　　在中风病文献数据库的建立的基础上，采用频数分析法分析得出：唐宋以前，67味高频药物，其中，解表药、补益药、祛风湿药使用频率最高；金元时期，52味高频药物，其中，补益药、化痰类药、解表药、平肝熄风药使用频率最高；明清两朝，70味高频药物，其中，补益药、解表药、化痰类药、平肝熄风药使用频率最高；近现代时期，47味高频药物，其中，补益药、平肝熄风药和化痰类药使用频率最高；总库中，78味高频药物，其中，补益药、解表药、化痰类药、平肝熄风药、祛风湿药、活血化瘀药、温里药、消热药、理气药、开窍药等十类药物均有较高频率的使用。
　　采用柱状图表分析方法横向对比同朝代各类药物味数及古所有药物百分比(结果同频数分析法)；纵向对比不同朝代的常用药类，解表药以唐宋以前时期作用频率最高，近现代时期最低；祛风湿药的使用频率随时间依次递减；补益药的使用频率均在该时期所有使用药物的10%之上，明清时期最高；平肝熄风药以近现代时期使用频率最高；化痰类药物使用频率随时间呈上升趋势；活血化瘀药和开窍药在各时期中风病的治疗上所使用频率变化不大。
　　2无监督数据挖掘技术的中风病新处方发现研究
　　从古今中风病文献总数据库中分别筛选出气虚血瘀证、风痰阻络证、痰热内闭证、阴虚风动证四个证型的方药。分析277首气虚血瘀证型方药，得出78味高频药物，分别应用改进的互信息法这[1]和复杂系统熵聚类[2-3]方法，得到44个药对，61个核心组合，对药对、核心组合经验配伍，得到3个该证型新处方(参龙活血方为其一)；分析213首风痰阻络证型方药，得出53味高频药物，分别应用上述方法，得到26个药对，19个核心组合，3个该证型新处方；分析128首痰热内闭证型方药，得出43味高频药物，分别应用上述方法，得到26个药对，19个核心组合，3个该证型新处方；分析64首阴虚风动证型方药，得出28味高频药物，分别应用上述方法，得到20个药对，19个核心药物组合，3个该证型新处方。
　　3参龙活血方对实验性脑缺血大鼠行为学、脑梗死面积和组织形态的影响
　　神经行为学评分结果：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组大鼠的后肢运动的协调和整合能力、四肢肌力、前肢放置功能等行为表现均较差(P＜0.01)；与模型相比较，参龙活血方大剂量明显改善局灶性脑缺血模型大鼠行为学评分(P＜0.01)，参龙活血方小剂量组和尼莫地平组改善不明显。
　　组织形态学结果：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织形态损伤严重；与模型组比较，参龙活血方大剂量组和尼莫地平组可见神经细胞缺血性改变明显减轻，血管周围间隙和神经细胞周围间隙增宽明显减轻，坏死细胞数量明显减少。参龙活血方小剂量组缺血性改变减轻不明显。
　　脑梗死面积测定结果：脑缺血后7d，与假手术组比较，模型组大鼠梗死面积显著增大(P＜0.01)；与模型组比较，参龙活血方大剂量组能明显缩小脑缺血大鼠脑梗死面积(P＜0.01)，参龙活血方小剂量组、尼莫地平组均能明显缩小脑缺血大鼠脑梗死面积(P＜0.05)。
　　4参龙活血方对实验性脑缺血大鼠血脑屏障通透性的影响及保护作用机制的研究
　　血清IL-1β水平检测结果：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组IL-1β含量显著增高(P＜0.05)；与模型组比较，参龙活血方大剂量组可显著降低IL-1β含量(P＜0.05)，参龙活血方小剂量组、尼莫地平组无统计学差异(P＞0.05)。
　　血清IL-10水平检测结果：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组IL-10含量显著降低(P＜0.05)；与模型组比较，参龙活血方大剂量组可显著增高IL-10含量(P＜0.01)，参龙活血方小剂量组、尼莫地平组明显增高IL-10含量(P＜0.05)。
　　血清SOD水平检测结果：脑缺血后6h和7d，与假手术组比较，模型组SOD含量显著降低(P＜0.05，P＜0.01)；脑缺血后6h、7d，与模型组比较，参龙活血方大剂量组、尼莫地平组均可显著增高SOD含量(P＜0.01)，参龙活血方小剂量组明显增高SOD含量(P＜0.05)。
　　血清MDA水平检测结果：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组MDA含量显著增高(P＜0.01)；与模型组比较，参龙活血方大剂量组可显著降低MDA含量(P＜0.01)，参龙活血方小剂量组、尼莫地平组明显降低MDA含量(P＜0.05)。
　　血脑屏障通透性检测结果：脑缺血后6h，与假手术组比较，模型组伊文思蓝OD值显著增高(P＜0.05)；与模型组比较，参龙活血方大剂量组、尼莫地平组均可显著降低伊文思蓝OD值(P＜0.05)，参龙活血方小剂量组无统计学差异(P＞0.05)。
　　透射电镜观察血脑屏障超微结构的变化：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组的BMECS损伤严重；与模型组比较，各用药组均有所改善，参龙活血方大剂量组可见BBB结构较完整，未见TJ明显开放，毛细血管周围轻度水肿。脑缺血后6h，参龙活血方小剂量组可见TJ处于半开放状态，毛细血管周围中度水肿；脑缺血后7d可见TJ结构模糊不清，毛细血管周围水肿较轻。尼莫地平脑缺血后6h末见TJ明显开放，细胞膜模糊不清，毛细血管周围水肿较轻，脑缺血后7d可见TJ处于半开放状态，毛细血管周围轻度水肿。
　　紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的mRNA表达水平检测结果：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组三个蛋白的mRNA表达水平最低；脑缺血后6h，与模型组比较，参龙活血方大剂量组三个蛋白的mRNA表达水平增高明显，参龙活血方小剂量组与尼莫地平组表达水平相当，低于参龙活血方大剂量组。脑缺血后7d，与模型组相比，用药组各蛋白mRNA发达水平均有不同程度的增高，蛋白ZO-1的mRNA表达水平参龙活血方小剂量组稍高于大剂量组。另两个蛋白mRNA表达水平参龙活血方大剂量组略高于小剂量组。
　　免疫组化染色观察紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5表达水平变化：脑缺血后6h、7d，与假手术组比较，模型组表达显著减弱；与模型组比较，参龙活血方大、小剂量组、尼莫地平组蛋白阳性分布紧密且着色明显，其中以参龙活血方大剂量组阳性表达最明显，尼莫地平组、参龙活血方小剂量组蛋白阳性表达较为明显。
　　结论：
　　1建立中风病文献数据库，从中挖掘出各历史时期中风病的证治规律与用药特点，拓展了其内涵，为中风病的诊疗提供了理论和临床依据。
　　2把复杂系统分析方法应用到中风病文献挖掘，通过挖掘药物组合中潜在的配伍规律，发现新的具有临床应用价值中风病不同证型的新组方。
　　3对数据挖掘的代表方进行了实验有效性验证和初步机制探讨，为中药复方研发新模式和途径进行了初步探索。