PreS1感染决定区随机化HBV库的构建及其感染常用小动物的初步研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒，对宿主的特异性要求非常严格，只能感染与其天然宿主种属关系接近的动物。目前用于研究HBV感染的动物模型主要有黑猩猩、树鼩、土拔鼠、鸭及各种小鼠模型，但由于来源困难、价格昂贵、感染效率低、结果稳定性差、繁殖率低、凶猛难操作、模型制备困难，不能完全重复HBV的整个感染周期等各种原因，限制了它们的应用。为了弥补上述缺陷，构建新型乙型肝炎动物模型当前研究HBV的热点及难点。
　　多年的研究证实，HBV的PreS1区参与病毒感染早期的结合及进入，决定了宿主的种族及组织特异性。其中有试验指出其主要活性部位最小可限制在aa5-20序列。基于此原理，本课题采用基因重组技术分别对HBVPreS1区的aa9-17、aa12-21、aa16-24序列进行随机化改造，构建PreS1感染决定区随机的复制型HBV载体库，并对其感染常用小动物进行初步研究。本课题由两部分构成。
　　第一部分、PreS1感染决定区随机化HBV库的构建
　　目的：对HBV PreS1区的aa9-17、aa12-21和aa16-24序列分别进行随机化改造，构建PreS1感染决定区随机化HBV库。
　　方法：
　　1.应用基因重组技术，以pCH-3093为载体，依次构建3种过渡质粒pCH-3093-Alw(-)、pCH-3093-AlwN1、pCH-3093-Insert。
　　2.设计并合成PreS1区的3种随机引物S1 rand9-17、S1 rand12-21、S1 rand16-24及一种3’端与随机引物互补的引物S11038(-)。三种随机引物分别与S11038(-)引物在Klenow Fragment作用下延伸为双链，即可合成随机片段。
　　3.通过一系列质粒构建，将随机片段插入到野生型HBV相应的PreS1区，即可构成PreS1感染决定区随机化HBV库。
　　4.检测PreS1感染决定区随机化HBV库的库容、随机性及复制能力。
　　结果：
　　1.本研究成功构建了3种过渡质粒pCH-3093-Alw(-)、pCH-3093-AlwN1、pCH-3093-Insert，并进行了大小及酶切位点鉴定。
　　2.合成了PreS1区的3种随机引物S1 rand9-17、S1 rand12-21、S1 rand16-24及1种与随机引物的3’端互补的引物S11038(-)。并成功合成了3种随机片段，将3种随机片段插入到野生型HBV PreS1的相应区域，构建了PreS1感染决定区随机化HBV库。
　　3.通过统计分析证实，三种随机库库容约为107，氨基酸的实际分布与理论频数无显著性差异，并扩增获得大量高纯度的随即库质粒。SouthernBlotting检测证实，三种随机库的复制能力接近，比野生型HBV弱。
　　结论：本研究成功构建了3种PreS1感染决定区随机化HBV库pCH-S1-917、pCH-S1-1221、pCH-S1-1624，随机库具有较大的库容及良好的随机性。3种随即库的复制能力接近，但比野生型HBV弱。考虑随即库种的某些碱基影响了病毒的复制能力，但并不影响随即库的应用。这3种随机库为探索相应HBV动物模型提供了一种便利的试验工具。
　　第二部分、应用PreS1感染决定区随机化HBV库感染常用小动物
　　目的：利用PreS1感染决定区随机化HBV库感染Wistar大鼠、SD大鼠、BALB/C小鼠、和新西兰小白兔，了解病毒库的感染能力。
　　方法：
　　1.分别给Wistar大鼠、SD大鼠、BALB/C小鼠和新西兰小白兔注射3种PreS1感染决定区随机性HBV库pCH-S1-917、pCH-S1-1221、pCH-S1-1624，并于1个月和2个月后分别化验血清HBV-DNA定量。
　　2.注射病毒后2个月时，处死动物并分别提取肝组织内的HBV cccDNA。以所提取的HBV cccDNA为模板，扩增HBV PreS1区的随机序列，将随机序列插入到野生型HBV的相应部位，构建二代PreS1感染决定区随机化HBV库，并进行测序。
　　3.应用二代随机库再次注射相应动物，并于1个月和2个月时分别化验血清HBV-DNA定量。
　　4.2个月时取感染动物的肝组织行免疫组织化学检查，了解HBsAg和HBcAg的表达情况。
　　结果：
　　1.注射病毒后动物的一般情况良好，较注射前无明显变化，1个月时化验血清HBV-DNA定量。化验结果显示所有注射随机病毒的动物均阳性，W7的病毒滴度量最高，为2.43×105copies/mL；其余定量介于103-104copies/mL之间。注射野生型的对照动物均阴性。
　　2.新西兰小白兔和BALB/C的肝组织中可扩增出相应的HBV PreS1感染决定区的随机片段，而Wistar大鼠、SD大鼠阴性对照动物扩增结果均为阴性，可能在注射病毒2个月后Wistar大鼠和SD大鼠大鼠体内的病毒已清除。
　　3.将从兔子和BALB/C小鼠肝组织内所扩增出的随机片段插入到野生型HBV的相应序列内，成功构建了二代PreS1感染决定区随机化HBV库pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse。
　　4.对随机库pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse进行测序，结果显示前者21个菌落均来自随机库pCH-S1-1221；后者除1个来自pCH-S1-917，其余的15个来自随机库pCH-S1-1221。
　　5.二代随机库pCH-S1-rabbit和pCH-S1-mouse分别感染兔子及BALB/C小鼠，于第1个月和第2个月时化验血清船HBV-DNA，结果显示前后两个月的病毒定量无明显变化，均为弱阳性。
　　6.第一和第二代病毒库所感染动物的肝组织均有HBsAg和HBcAg的表达。以Wistar大鼠表达量最高，肝细胞内外均可检测到。
　　结论：应用PreS1感染决定区随机化HBV库成功感染了Wistar大鼠、Sprague Dawley大鼠、新西兰小白兔和BALB/C小鼠。并可在血清内检测出HBV-DNA，于肝组织内检测出HBsAg和HBcAg两种抗原的表达。于肝组织内扩增出感染的HBV基因组并测序，结果证实HBV PreS1区aa12-21序列在HBV感染过程中具有重要作用，并在一定程度上影响着HBV的宿主特异性。但随机库所引起的感染也为急性过程，需进行进一步改造，试图在基因水平上抑制宿主的免疫反应，从而达到慢性感染，为研究HBV提供一种更为理想的感染动物模型。