大黄(庶虫)虫丸对UUO大鼠肾小管间质血管皮生长因子及血管生长成素1/2表达的影响

摘要

目的：通过采用单侧输尿管结扎(UUO)制作大鼠肾小管间质纤维化模型，观察各组UUO大鼠梗阻侧肾组织小管间质血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)以及血管生成素-2(Ang-2)表达的变化，探讨化瘀通络中药大黄()虫丸对肾小管间质微血管的影响及其作用机制，以期为临床应用提供实验依据。
　　肾脏微血管结构的破坏和缺失，特别是肾小管周围毛细血管(peritubular capillaries，PTC)的破坏、丢失，在各种肾脏疾病进程中的作用近年极受关注。肾小管间质纤维化是各种进展性肾脏疾病的共同通路，它的发生与PTC的破坏和缺失密切联系。探讨肾小管间质纤维化的发生发展机制，防止和延缓肾小管间质纤维化，成为防治慢性肾脏病进展的关键问题之一。因此，从PTC破坏和缺失的角度开展相关研究，具有十分重要的意义。UUO是目前研究肾小管间质纤维化的理想模型，可以反映人类梗阻性肾病和纤维化肾脏疾病的过程，因而我们选取此种模型进行本研究。
　　肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病迁延不愈，最终均导致慢性肾功能衰竭的共同病理基础。慢性肾脏疾病肾功能衰竭属中医“水肿”“关格”“癃闭”等病证的范围，近两年也有医家[1]根据RIF的ECM过度积聚和成纤维细胞增殖的病理特点认为它与中医的癥积相类似。汉代医家张仲景《金匮要略·水气病脉证并治第十四》篇提出“血不利则为水”，强调血行不畅及瘀血在水气病形成中的重要地位和作用，为后世历代医家所重视，同时，慢性肾脏疾病肾功能衰竭是慢性久病，“久病入络”，“久病必瘀”是其基本病机之一，活血化瘀、祛瘀生新是中医治疗慢性肾脏疾病肾功能衰竭的重要治法。大黄(庶虫)虫丸即出自张仲景《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治第六》，该方能够化瘀通络、祛瘀生新，是临床用于治疗该病的常用方剂之一。
　　本实验应用UUO大鼠复制肾小管间质纤维化模型，同时予大黄(庶虫)虫丸治疗，缬沙坦对照，观察UUO大鼠肾脏肾小管间质血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)以及血管生成素-2(Ang-2)等各项指标的变化，探讨大黄()虫丸对UUO大鼠的作用机制，为大黄(庶虫)虫丸更好的应用于临床提供理论依据。
　　方法：
　　1选用健康清洁级雌性SD大鼠50只，体重170±10g，适应性喂养一周，测尿蛋白阴性后，逐一称重按重量标号，按照随机分配的原则分为5组，每组10只：假手术组(Shamp group，S)、模型组(Model group，M)、缬沙坦组(Valsartan group，Ⅴ)、大黄(庶虫)虫丸中剂量组(DHZCM group，DM)、大黄()虫丸高剂量组(DHZCH group，DH)。其中除S组外，其余各组均行左侧输尿管结扎，构建UUO大鼠模型。
　　2实验给药：根据人用药量与实验动物用药剂量的换算公式，计算出大鼠的用药量。五组均喂普通饲料，S、M组灌胃蒸馏水(10ml·kg-1·d-1)；其余三组分别给予缬沙坦(10mg·kg-1·d-1)、大黄()虫丸水溶液中剂量(3g·kg-1·d-1)、大黄()虫丸水溶液高剂量(6g·kg-1·d-1)灌胃。每日治疗1次，连续治疗14天。实验周期共2周。
　　3指标检测：于实验结束前一天称重后将大鼠置于代谢笼中，正常饮水禁食下收集24 h尿液，测24 h尿量及24 h尿蛋白定量；实验结束时断头取血，用于检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)，并计算肌酐清除率(Ccr)；取左侧部分肾脏组织迅速置于4％多聚甲醛液中固定，脱水，石蜡包埋，行HE、Masson染色，用于光镜下观察肾脏皮质区及皮髓交界区肾小管及间质的结构和变化及免疫组化法检测肾组织血管内皮生长因子(VEGF)、以及血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)的表达。
　　结果：
　　1一般情况及24h尿蛋白定量检测结果
　　假手术组大鼠精神状况、毛发、活动、饮食、饮水等无明显改变；模型组大鼠被毛松弛紊乱，毛色差，厌食，懒动；缬沙坦组与大黄()虫丸中剂量组、大黄()虫丸高剂量组大鼠饮食、体重、活动情况等整体状况均较模型组有所改善。各组间24h，尿蛋白定量比较无明显差异(P＞0.05)。
　　2各组大鼠肾功能检测结果
　　BUN测定结果，与假手术组比较，模型组大鼠BUN水平明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，缬沙坦组、大黄(庶虫)虫丸中剂量组和大黄()虫丸高剂量组大鼠BUN水平下降有显著性差异(均为P＜0.01)。与缬沙坦组比较，大黄()虫丸中剂量组、大黄()虫丸高剂量组大鼠BUN水平下降有显著性差异(均为P＜0.01)。但大黄()虫丸中剂量组和大黄()虫丸高剂量组之间无明显差异(P＞0.05)。
　　Scr测定结果，与假手术组比较，模型组Scr水平明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，缬沙坦组、大黄()虫丸中剂量组和大黄廑虫丸高剂量组Scr水平下降有显著性差异(均为P＜0.01)。缬沙坦组与大黄()虫丸中剂量组、大黄()虫丸高剂量组比较Scr水平下降有显著性差异(均为P＜0.01)，大黄()虫丸高剂量组较大黄()虫丸中剂量组Scr水平下降有显著性差异(P＜0.01)。
　　各组间Ccr比较无明显差异(P＞0.05)。
　　3光镜下肾组织病理形态学观察
　　假手术组肾组织未见病理改变；模型组HE染色可见肾皮质变薄，肾小管上皮细胞肿胀，部分坏死脱落，部分肾小管呈灶状萎缩，管腔扩张，间质明显增宽，间质内可见大量炎性细胞浸润；Masson染色可见增宽的间质区大量胶原纤维增生，间质纤维化呈灶状分布；大黄()虫丸中、高剂量组和缬沙坦组HE和Masson染色肾小管和肾间质病理改变较模型组明显改善，肾小管较少萎缩、管腔轻度扩张，上皮细胞坏死脱落较少，肾间质增宽较轻、少量炎性细胞浸润。
　　4免疫组化检测VEGF、Ang-1及Ang-2的表达
　　VEGF测定结果，假手术组VEGF主要在肾小管上皮细胞及肾小球脏层上皮细胞表达，部分小管周围细胞也有表达；模型组除上述部位表达外，肾小球系膜细胞有少量VEGF表达，而且肾间质VEGF表达显著下降(P＜0.01)。缬纱坦组、大黄()虫丸高剂量组表达较模型组明显增强(均为P＜0.01)，大黄()虫丸中剂量组与模型组相比无明显差异(P＞0.05)，三个治疗组之间无明显差异(P＞0.05)。
　　Ang-1测定结果，假手术组主要表达于肾小管上皮细胞，模型组表达明显减弱(P＜0.001)，缬纱坦组及大黄()虫丸中剂量组、大黄()虫丸高剂量组较模型组表达明显增强(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.001)，大黄()虫丸高剂量组优于缬沙坦组和大黄()虫丸中剂量组(P＜0.05)，缬沙坦组和大黄()虫丸中剂量组之间无明显差异(P＞0.05)。
　　Ang-2测定结果，假手术组主要表达于肾小管上皮细胞，模型组表达明显减弱(P＜0.01)，缬纱坦组及大黄()虫丸中剂量组、大黄()虫丸高剂量组较模型组表达明显增强(均为P＜0.05)，且三组之间无明显差异(P＞0.05)。
　　结论：
　　1大黄(庶虫)虫丸可以降低UUO致肾间质纤维化大鼠血BUN、Scr水平，对肾功能有一定保护作用。
　　2通过增加肾组织中VEGF、Ang-1及Ang-2的表达水平，保护肾小管周围毛细血管内皮细胞和逆转损伤的血管生成，可能是大黄(庶虫)虫丸延缓肾小管间质纤维化的作用机制之一。