慢性粒细胞白血病急变期骨髓间充质干细胞生物学特性及基因表达谱的实验研究

摘要

目的：慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于异常造血干细胞克隆的骨髓增殖性疾病，细胞遗传学特征是具有Ph染色体(philadelphiachromosome)，即t(9；22)(q34；q11)，在其分子水平形成BCR/ABL融合基因。CML从慢性期发展到急变期，往往伴随着BCR/ABL mRNA水平的明显升高。BCR/ABL与CML的发病密切相关。CML的自然病程可以分为慢性期(chronic phase，CP)、加速期(accelerated phase，AP)和急变期(blast crisis phase，BP)。进展到急变期后生存期仅3-6个月，治疗效果差，急性变是引起患者死亡的主要原因。如何阻止CML急变的发生是治疗中的关键。这就要求深入了解CML急变的分子机制，早期诊断早期治疗，具有重要的临床意义。研究CML急变发病机制，寻找适合的治疗靶点，已成为国内外研究的热点。现普遍认为，慢性粒细胞白血病的急变涉及多基因、多信号通路调控的异常。涉及到癌基因、抑癌基因的改变，端粒酶的激活，染色体异常变化以及DNA修复功能的异常等多种原因。目前大部分的研究都集中在造血干细胞的异常，例如发现大部分急变患者都有bcr/abl融合基因的异常，另外常常伴随其它基因异常，如抑癌基因p53、p16和Rb，癌基因ras、mye及转化基因Evi-1等，但是对于骨髓间充质干细胞(BMMSCs)在慢性粒细胞白血病急变中的意义却鲜有人关注。
　　骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是存在于骨髓当中，不同于造血干细胞的另一类骨髓干细胞，最早由Friedenstein于1968年从骨髓中分离出来发现。具有自我更新、多向分化的能力。BMMSCs在特定条件下可以分化为多种细胞如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞等，同时分泌多种细胞因子，参与造血微环境的组成。通过与造血细胞直接接触和表达多种细胞因子，实现对造血细胞增殖和分化的调节作用。
　　BMMSCs作为另一类骨髓干细胞，参与造血微环境的组成，与造血细胞关系密切。虽然CML急变原因仍不清楚，但是近期的一些研究发现，多数肿瘤细胞是因为信号通路的异常活化而获得了超强的无限增值能力。从这一角度出发，我们想到，急变期BMMSCs功能是否异常，与正常人及慢性期BMMSCs有无区别，在CML急变中扮演何种角色，起到何种作用？CML急变是否有BMMSCs的参与？是由于其本身的变化引起了CML急变，还是白血病细胞急变在先，或是二者之间的相互作用最终导致了CML急变？这些问题都需要进一步的探索研究。本研究以急变期BMSC为研究对象，完成CML患者急变期和慢性期BMSC的培养纯化及鉴定，了解CML二期的BMSC在增殖，分化，凋亡等方面的异同点，分别将K562细胞和CML急变期原代细胞与急变期BMMSCs共培养，对比CML慢性期和正常人的BMMSCs，观察急变期BMMSCs对K562细胞及白血病原代细胞增殖、凋亡的影响，并检测其可能的作用机制，探讨BMMSCs参与的信号传导通路在白血病发病中的作用机制。最后通过基因芯片的研究，了解CML急变期的BMSC的基因表达的特点，筛选出关键的差异基因及信号通路变化，从一个全新的、易于实施的研究思路，从BMMSCs的角度探讨CML急变的特点。
　　方法：
　　1.分离培养扩增CML慢性期BMMSCs和急变期患者BMMSCs；以正常人为对照组。观察急变期患者BMMSCs的原代细胞培养的特点，以及扩增传代的特征。
　　2.显微镜下观察急变期BMMSCs的形态变化：于倒置相差显微镜下观察BMMSCs细胞形态，选取生长良好的P3代以后的细胞，进行瑞氏染色、固定，显微镜下观察形态并照相。
　　3.流式细胞仪检测急变期BMMSCs的表面标志与慢性期和正常组比较有无差异。
　　4.MTT法测定急变期BMMSCs生长曲线特点，并观察集落形成(CFU-F)的数量变化。
　　5.流式细胞仪方法检测急变期BMMSCs的细胞周期分布及自发的细胞凋亡。
　　6.用RT-PCR检测CML急变期BMMSCs表达造血生长因子(SCF、IL-12、TPO、IL-6、GM-CSF)及成脂成骨分化的标志基因，同时检测Bcr/abl融合基因，与CML慢性期的BMMSCs比较，了解有无差异。
　　7.加入分化诱导液研究CML急变期患者BMMSCs和慢性期BMMSCs成脂肪成骨分化能力的检测，以正常人为对照，。
　　8.通过人类全基因组表达谱芯片，研究CML慢性期BMMSCs和急变期患者BMMSCs，了解CML急变期的BMSCs的基因表达的特点，寻找异常表达的基因，荧光实时定量PCR检测分析鉴定基因芯片的准确性。
　　9.建立BMMSCs与K562细胞或CML-BP原代细胞的共培养体系，直接计数法和MTT法检测BMMSCs对K562细胞或原代细胞增殖的影响，以及BMMSCs对阿霉素处理的K562细胞和原代细胞增殖，细胞活力的影响。
　　10.Annexin V/PI染色标记细胞检测细胞凋亡。实验分组①对照组：K562细胞或原代细胞加ADM处理组；②Nc-BMMSCs+ADM组：Nc-BMMSCs与K562细胞或原代细胞共培养加ADM处理组；③Cp-BMMSCs+ADM组：Cp-BMMSCs与K562细胞或原代细胞共培养加ADM处理组；④Bp-BMMSCs+ADM组：Bp-BMMSCs与K562细胞或原代细胞共培养加ADM处理组。④Bp-BMMSCs+ADM+重组人DKK1蛋白组：Bp-BMMSCs与K562细胞或原代细胞共培养加ADM处理，并加入重组人DKK1蛋白。
　　11.蛋白印迹(WB)检测凋亡相关蛋白：激活的的caspase-3、Bcl-2、Bax和bate-catenin的蛋白水平的变化。
　　结果：
　　1.原代CML急变期BMMSCs，生长缓慢，克隆形成的较少，贴壁的细胞也较少，融合时间延长。但在传代至P3代以后，细胞增殖能力增强，与CML慢性期BMMSCs及正常对照组比较基本一致。
　　2.细胞生长曲线显示CML急变期BMMSCs具有潜伏期，对数生长期，平台期的生长特点。
　　3.原代CML急变期BMMSCs较慢性期BMMSCs和正常对照组的CFU-F形成能力减弱，后两者没有明显区别。
　　4.CML急变期BMMSCs的自发凋亡6.54±1.08%，G0/G1期比例占89.92±0.89%，与慢性期BMMSCs和正常组BMMSCs比较没有统计学差异，多向分化能力的实验表明，急变期BMMSCs可向成脂成骨诱导分化，RT-PCR可检测到成脂成骨分化的标志性基因，与慢性期BMMSCs及正常组比较没有明显区别。
　　5.BMMSCs表达细胞因子的检测
　　CML急变期和慢性期BMMSCs都不表达Bcr/abl融合基因。本研究中检测了IL-6，SCF，TPO，G-CSF，IL-12的表达特点。结果显示：二种BMMSCs都表达IL-6，SCF，TPO，G-CSF，IL-12，但是急变期BMMSCs表达IL-6，IL-12，SCF，IPO下降。
　　6.表达谱芯片检测结果：共得到558条差异基因，其中上调基因289条，下调基因269条。GO分析显示两组间的差异基因与以下GO条目有关：与细胞进程相关的差异表达基因298条，与细胞水平上的细胞组分形成相关基因76条，与细胞粘附相关基因28条，与生物粘附相关基因28条，与染色体组织相关基因23条，与G蛋白偶联受体蛋白信号通路相关基因20条，与调节G蛋白偶联受体蛋白信号通路相关基因10条，与细胞连接组件相关基因8条，以及很多涉及到糖原相关代谢的调控，DNA包装及DNA构象变化，成骨细胞分化的调控等方面。经过实时定量PCR验证，基因芯片结果真实可靠。
　　7.BMMSCs对K562细胞及CML急变期原代细胞增殖的影响：
　　7.1 CML急变期BMMSCs与K562细胞及CML急变期原代细胞共培养
　　NC-BMMSCs、CML-CP-BMMSCs和Bp-BMMSCs与K562细胞共培养，细胞计数显示：三组BMMSCs均可抑制K562细胞的生长(0.662±0.13*105 Vs.1.319±0.02*105，0.677±0.21*105 Vs.1.319±0.02*105，0.809±0.21*105 Vs.1.319±0.02*105，P<0.05)。三组之间比较，CML-Bp-BMMSc的抑制作用较弱。
　　为了解CML-Bp-BMMSCs对CML急变期原代细胞增殖的影响，我们选取了4例CML急变期白血病细胞与BMMSCs进行共培养：每组取1*105个原代白血病细胞，与BMMSCs共培养比例为10:1，即共培养组BMMSCs取1*104个。48小时后，单独培养组的原代细胞计数为0.727±0.02*105，三个共培养组细胞数分别为NC组0.647±0.01*105，Cp组0.617±0.01*105，Bp组0.708±0.0*105，都比单独培养组细胞数少。但单独培养组与Bp-BMMSCs共培养组比较差异没有统计学意义。
　　7.2急变期BMMSCs对阿霉素诱导的K562细胞及CML急变期原代细胞增殖及细胞活力检测
　　K562细胞单独培养组加入阿霉素48小时后的细胞活力明显下降至73.13±2.42%，而与急变期BMMSCs共培养组细胞活力为83.78±5.17%，差异有显著性(P<0.05)。正常组BMMSCs和慢性期BMMSCs分别于K562细胞共培养，检测细胞活力分别为75.45±3.27%和77.56±3.11%(P>0.05)。
　　正常组BMMSCs，慢性期BMMSCs组和急变BMMSCs分别与CML急变期原代细胞共培养加阿霉素处理后，细胞活力分别为51.47±3.22%，56.36±2.39%和65.69±3.24%，差异有显著性(P<0.05)。三组比较，急变期BMMSCs共培养组细胞活力最强(P<0.05)，正常BMMSCs和慢性期BMMSCs共培养组间比较没有区别(P>0.05)。
　　8.急变期BMMSCs保护K562细胞减少阿霉素诱导的凋亡
　　阿霉素处理K562细胞单独培养组凋亡率为23.1±2.45%，正常BMMSCs，CML慢性期BMMSCs及急变期BMMSCs分别与K562细胞共培养，加阿霉素48小时后的细胞凋亡率分别为19.9±0.82%，18.5±1.63%和13.4±2.15%，均低于K562细胞单独培养加药组(P<0.05)。三组间比较，急变期BMMSCs对K562细胞的保护作用最强(P<0.05)。后两个共培养组之间比较差别不显著(P>0.05)。检测CML急变期原代细胞分别与三种BMMSCs共培养加阿霉素处理的结果与上述研究一致。
　　9.凋亡通路相关蛋白的检测：
　　阿霉素处理K562细胞后，Bcl-2蛋白明显下调，Bax蛋白水平和激活的Caspase-3蛋白水平出现上调，Bcl-2/Bax比值下降。与急变期BMMSCs共培养，Bcl-2蛋白再次上调，Bax蛋白水平和激活的Caspase-3蛋白水平均下调。CML急变期BMMSCs可通过调控凋亡通路相关蛋白的表达，减少阿霉素对细胞的凋亡诱导作用。CML慢性期BMMSCs共培养组也出现类似改变，但程度较弱。
　　10.DKK1中和抗体逆转BMMSC对K562细胞的保护作用
　　实验观察到急变期BMMSCs拮抗ADM诱导的K562细胞凋亡，而加入DKK1中和抗体后，部分逆转了BMMSCs的保护作用，导致K562细胞凋亡率增加(13.4±2.15% Vs.16.3±1.67%，P<0.05)。
　　结论：
　　1 CML急变期原代BMMSCs生长缓慢，克隆形成少，融合时间延长。并且较慢性期BMMSCs和正常对照组的CFU-F形成能力减弱，后两者没有明显区别。但成功传代至P3代以后，细胞增殖能力增强，与CML慢性期BMMSCs及正常对照组比较基本一致，具有潜伏期，对数生长期，平台期的生长特点。
　　2 CML急变期BMMSCs高表达表达间充质干细胞表面标记CD44，CD90，CD106，低表达或不表达造血干细胞标记CD34和CD45，符合间充质干细胞的免疫学特征。经分化培养可向成脂成骨诱导分化，自发凋亡6.54±1.08%，G0/G1期比例占89.92±0.89%，与慢性期BMMSCs和正常组BMMISCs比较没有统计学差异。
　　3 CML急变期和慢性期BMMSCs都不表达Bcr/abl融合基因，急变期BMMSCs表达IL-6，IL-12，SCF，TPO下降。说明急变期BMMSCs支持造血能力减弱。
　　4通过基因芯片分析，发现CML急变期与慢性期BMMSCs的基因表达谱有明显的区别。两组间存在差异显著的信号通路，包括粘附分子、细胞凋亡、炎症反应相关通路和细胞结构和完整性相关通路等。GO分析从生物学方面指出，两组间差异基因大部分涉及到：细胞进程，细胞水平上的细胞组分形成，细胞粘附，G蛋白偶联受体蛋白信号通路等方面。
　　5 CML急变期BMMSCs能抑制K562细胞增殖，但对原代细胞增殖抑制不明显。急变期BMMSCs能部分拮抗阿霉素对K562细胞及原代细胞的增殖抑制作用。
　　6.CML急变期BMMSCs拮抗阿霉素诱导的K562细胞凋亡，与慢性期和正常BMMSCs比较，其对K562细胞的保护作用最强(P<0.05)。
　　7.CML急变期BMMSCs通过调控凋亡通路相关蛋白的表达，例如上调BCL-2，下调Bax和激活的Caspase-3蛋白水平，以及活化K562细胞的Wnt通路，拮抗阿霉素的凋亡诱导作用，实现对K562细胞的保护。DKK1中和抗体能部分逆转BMMSc的这种保护作用。