喉鳞癌微环境乏氧的客观评估及有效改善乏氧对喉鳞癌化疗抵抗的影响

摘要

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是人类常见的恶性肿瘤之一，在世界恶性肿瘤排名中位居第六，每年新发病例数超过50万。该病具有起病隐匿、侵袭力强、易复发和转移以及预后差的特点。尽管治疗手段的不断改善使得患者生活质量有了极大提高，但近30年头颈鳞癌患者的术后5年生存率并未得到明显提高。在对头颈部鳞癌进行综合治疗过程中我们发现，头颈鳞癌对放化疗敏感性低，抵抗力强，疗效不佳。治疗抵抗和复发一直是头颈鳞癌治疗中一个悬而未解的难题。因此，深入研究肿瘤发生机制，寻求有效检测手段，探讨最佳治疗方案将对提高头颈鳞癌治疗效果起到关键作用。
　　目前观点认为，肿瘤细胞生长的微环境在肿瘤发生发展以及治疗抵抗和复发中具有重要作用，其中局部组织内缺氧造成的乏氧微环境与肿瘤治疗抵抗和复发的关系密不可分。
　　乏氧是实体瘤的一个重要病理特征，是肿瘤细胞恶性增殖与血液供应失衡的结果。肿瘤微环境乏氧的存在使肿瘤细胞的一些基因转录活性发生改变，其表达产物的变化使肿瘤细胞在适应乏氧微环境的同时，引起肿瘤生长、血管生成、转移、凋亡和对放化疗的抗拒性增强，在这个过程中转录因子HIF-1起着中枢纽带作用。HIF-1α基因是HIF-1的限速因子，它决定HIF-1的活性。HIF-1α在正常氧合细胞内很快被降解，但在乏氧时稳定性增加，从而可上调100余种基因的表达。其中血管内皮生长因子(Vescularendothelial growth factor，VEGF)和糖转运蛋白-1(glucose transporterprotein，Glut-1)作为促血管生成和糖酵解活性增强的两大主要因素，在肿瘤发生发展过程中起到不可低估的作用，阻断其中的某些重要环节对消除肿瘤治疗抵抗和复发具有重要作用。
　　既然乏氧可使肿瘤细胞产生针对放、化疗的保护蛋白，增加对放、化疗的抵抗性，而且肿瘤组织氧合状态直接影响着治疗方案的选择以及预后的评价等方面，那么，对肿瘤乏氧状况进行准确的测定，采取确实有效方法改善肿瘤微环境乏氧，从而提高治疗效果势在必行。目前，肿瘤组织的乏氧程度可以通过检测内源性缺氧标志物如葡萄糖转运酶(Glucosetransporter，Glut)以及现代影像学手段(如MRI和PET)进行客观评估。而在纠正肿瘤组织乏氧，提高治疗效果方面，主要存在下列几类方法：①直接或间接提高肿瘤内氧含量，如高浓度氧吸入，增加血红蛋白量及其携氧能力；②利用不同手段加强射线对乏氧细胞的杀伤作用；③应用乏氧细胞放射增敏剂；④应用乏氧细胞选择剂；⑤热疗；⑥基因疗法。虽然通过上述方法可以使肿瘤组织局部低氧状况得到改善，但影像学上观察到的结果与肿瘤细胞内源性缺氧标志物检测的实际结果的符合性较差，说明肿瘤组织局部氧分压恢复正常不能代表肿瘤细胞内缺氧代谢状况的彻底改善和纠正。肿瘤组织氧分压恢复正常与肿瘤细胞低氧代谢状况彻底改善和恢复之间可能存在着一定的窗口期。
　　基于上述一系列问题，本研究从喉鳞癌组织中乏氧相关基因的表达情况入手，探讨在头颈部鳞癌尤其喉癌方面，低氧对HIF-1α、Glut-1和VEGF的表达调控的影响、改善肿瘤组织乏氧情况后三者表达的动态变化，以及与化疗抵抗的关系。从而了解低氧对喉鳞状细胞癌发生和发展的影响及机制，确定改善肿瘤微环境乏氧的有效途径和检测方法，为临床肿瘤病人的治疗提供理论和方法学依据。实验大体分为五部分：
　　第一部分喉鳞癌组织中HIF-1α对Glut-1和VEGF表达的调控及与临床病理因素的相互关系
　　目的：检测喉鳞癌组织HIF-1α、Glut-1、VEGF的蛋白表达情况，并与临床病理因素进行相关分析，进一步通过体外实验验证上述三种基因的相互关系，从而论证低氧对喉鳞癌细胞HIF-1α及其下游靶基因Glut-1、VEGF的表达上调方面起到重要促进作用。
　　方法。
　　1以临床喉鳞癌患者病理组织切片为研究对象，免疫组织化学方法检测喉鳞癌组织中HIF-1α、Glut-1、VEGF的表达，并与临床诸病理因素进行相关分析。
　　2体外培养人喉鳞癌Hep-2细胞和HIF-RNAi-Hep-2细胞，MTT实验检测低氧对细胞增殖的影响。
　　3体外培养人喉鳞癌Hep-2细胞和HIF-RNAi-Hep-2细胞，采用RT-PCR技术检测其在不同氧分压条件下HIF-1α、Glut-1、VEGF的mRNA表达情况。
　　4免疫细胞化学技术和Western blot技术检测Hep-2细胞和HIF-RNAi-Hep-2细胞在不同氧分压条件下HIF.1a、Glut-1、VEGF的蛋白表达情况。
　　结果：
　　1临床免疫组化结果显示：35例喉癌患者组织切片中16例HIF-1α表达阳性(45.71％)，16例Glut-1表达阳性(阳性率45.71％)，19例VEGF表达阳性(阳性率54.29％)；16例HIF-1α表达阳性组织中，11例Glut-1表达阳性，14例VEGF表达阳性，即喉癌组织中HIF-1α的表达与Glut-1、VEGF呈正相关。部分喉癌标本表现为癌巢中阳性细胞成团分布；部分标本表现为强阳性，特别是癌组织周围腺体上皮部位表现为强阳性。HIF-1α和VEGF表达水平与喉癌的病理分级和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。Glut-1表达水平与淋巴结转移密切相关(P<0.05)。
　　2 MTT结果显示：低氧培养36h内，Hep-2细胞增殖速度加快，36h以上细胞增殖速度变缓，与常氧培养组细胞相比，差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-RNAi-Hep-2细胞增殖速度较Hep-2细胞明显减慢(P<0.05)。
　　3 RT-PCR结果显示：低氧条件下，Hep-2细胞的HIF-1α mRNA表达水平与常氧条件下其表达水平相比较，差异没有显著统计学意义(P>0.05)；而Glut-1和VEGF的mRNA在低氧条件下表达水平明显升高，与常氧培养对照组相比较，有显著统计学意义(P<0.05)。当HIF基因敲除后，Glut-1和VEGF的mRNA表达水平明显降低，在不同氧分压条件下其表达水平未见明显变化(P>0.05)。
　　4免疫细胞化学和Western blot方法检测结果显示：人喉鳞癌Hep-2细胞在低氧条件下HIF-1α、Glut-1、VEGF蛋白的表达明显高于常氧组，且具有一定的时间依赖性，36h内呈逐渐上升趋势，48h蛋白表达略有下降，与常氧组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α主要表达在细胞质或细胞核，Glut-1主要表达在喉癌细胞的细胞质和细胞膜，VEGF阳性表达呈棕黄色颗粒状，主要存在喉癌细胞的细胞质中。HIF-1α对Glut-1和VEGF蛋白表达存在正向调节(rGlut-1=0.937，P<0.05；rVEGF=0.909，P<0.05)。
　　结论：HIF-1α可作为转录调控因子参与调控Glut-1、VEGF的表达，进而在喉癌的发生、侵袭、转移过程中发挥重要作用。
　　第二部分改善喉鳞癌乏氧微环境对细胞内源性乏氧标志物表达影响的体外实验
　　目的：检测喉鳞癌Hep-2细胞系在改变氧分压后细胞的增殖情况，HIF-1α、Glut-1和VEGF mRNA及蛋白表达的动态改变，从而论证乏氧微环境的改变对喉鳞癌细胞内源性乏氧标志物表达的影响。
　　方法：
　　1以Hep-2人喉鳞癌细胞为实验对象，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测在低氧以及再氧合不同时间点(36h，36+6h，36+9h，36+12h，36+24h)细胞的增殖情况。
　　2免疫细胞化学方法和Western blot方法检测Hep-2细胞在低氧和再氧合不同时间点HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白表达改变情况。
　　3 RT-PCR检测Hep-2细胞在低氧和再氧合不同时间点HIF-1α、Glut-1和VEGF mRNA的动态变化。
　　结果：
　　1 MTT检测显示：Hep-2细胞在低氧培养36h，复氧6h、9h细胞增殖速度较相同时间点常氧对照组略高，复氧12h、24h细胞增殖速度低于相同时间点常氧对照组。
　　2免疫细胞化学方法检测显示：人喉鳞癌Hep-2细胞在低氧培养36h，恢复常氧培养9h后，HIF-1α、Glut-1、VEGF蛋白表达逐渐恢复到常氧培养水平。Western blot结果与细胞免疫化学结果一致，即低氧培养36h恢复常氧培养9h后，HIF-1α、Glut-1、VEGF蛋白表达逐渐恢复到常氧培养水平。
　　3 RT-PCR结果显示：低氧条件下，Hep-2细胞的HIF-1α mRNA表达水平与常氧培养对照组相比较没有显著性差异(P>0.05)；而Glut-1和VEGF的mRNA表达水平36h内均随低氧时间延长逐渐增加，与常氧培养对照组相比较有显著性差异(P<0.05)；恢复常氧培养9h后，Glut-1和VEGFmRNA表达水平恢复常氧水平(P>0.05)。
　　结论：人喉鳞癌Hep-2细胞在体外低氧条件下培养36h恢复常氧环境后细胞增殖变缓；低氧可引起Hep-2细胞HIF-1α、Glut-1、VEGF蛋白表达增加，当细胞恢复常氧培养9h后，HIF-1α、Glut-1、VEGF蛋白逐渐降低至常氧水平；乏氧对HIF-1α的调控，发生在转录翻译后水平，亦即蛋白质水平，而对Glut-1和VEGF的调控在转录水平就已发生。当细胞生活的乏氧微环境改变后，Glut-1和VEGF mRNA表达水平逐渐恢复常氧水平。
　　第三部分喉鳞癌Hep-2细胞系活体动物移植瘤模型的建立和18F-FDGPET客观检测
　　目的：建立喉鳞癌Hep-2细胞系活体动物移植瘤模型，通过对其进行不同方式的实验前处置，并在不同的时间点进行数据采集，观察肿瘤代谢情况和寻找移植瘤18F-FDG PET最佳成像条件，为喉鳞癌动物实验提供有利检测手段和方法。
　　方法：
　　1建立头颈鳞癌活体动物移植瘤模型并进行肿瘤大体观察，包括成瘤率、肿瘤生长曲线。
　　2对动物给予不同的实验前处置，并在不同的时间点进行数据采集，比较18F-FDG PET扫描图像质量。
　　结果：
　　1成功建立头颈鳞癌活体动物移植瘤模型，成瘤率100％。
　　218F-FDG PET结果：未禁食+保暖组动物肿瘤未见显像；禁食+未保暖组动物肿瘤显像率低，图像质量差；禁食+保暖组动物肿瘤显像率100％，且图像质量良好。不同的采集时间对图像质量影响不大。
　　结论：临床18F-FDG PET可用于裸鼠喉鳞癌移植瘤动物模型的研究；瘤体直径在0.8～1.5 cm进行PET显像比较适宜；实验前动物禁食过夜及实验中动物的保暖非常重要，直接影响图像质量；不同采集时间对图像质量影响不大。
　　第四部分卡波金吸入改善喉鳞癌Hep-2细胞活体动物移植瘤局部乏氧状况的客观评估
　　目的：采用18F-FDG PET技术观察荷瘤裸鼠在吸入卡波金气体前后肿瘤组织显像的改变，并通过免疫组化技术测定肿瘤组织内源性乏氧标志物表达的变化情况，对二者进行分析比较，从而证实肿瘤组织氧分压恢复正常与肿瘤细胞低氧代谢状况彻底改善和恢复之间存在一定的窗口期。
　　方法：
　　1建立头颈鳞癌活体动物移植瘤模型并进行肿瘤大体观察，包括成瘤率、肿瘤生长曲线。
　　2采用18F-FDG PET技术观察荷瘤裸鼠在吸入卡波金气体前后肿瘤组织显像的改变。
　　3将动物随机分为两组，分别给予卡波金气体吸入和空气吸入，取下肿瘤组织进行免疫组化和Western bolt检测，观察吸入卡波金前后肿瘤细胞乏氧状况的改善。
　　结果：
　　1成功建立头颈鳞癌活体动物移植瘤模型，成瘤率100％。
　　218F-FDG PET结果：空气吸入组动物肿瘤组织显像率100％，且图像质量良好，当给予卡波金吸入后，肿瘤组织显像明显变淡，与吸入前相比有统计学差异(P<0.05)。
　　3免疫组化结果和Western bolt结果显示：卡波金吸入前后，喉鳞癌Hep-2移植瘤细胞内源性乏氧标志物HIF-1α、Glut-1和VEGF的表达未见明显改变。
　　结论：卡波金吸入可有效减轻肿瘤组织局部乏氧代谢状况；肿瘤组织氧分压恢复正常与肿瘤细胞低氧代谢状况彻底改善和恢复之间存在一定的窗口期。
　　第五部分改善局部低氧微环境在喉鳞癌化疗治疗中的作用
　　目的：探讨改善人喉鳞癌Hep-2细胞低氧微环境对顺铂诱导的细胞凋亡的影响。
　　方法：
　　1以人喉鳞癌Hep-2细胞和HIF-RNAi-Hep-2细胞为实验对象，MTT法检测顺铂在常氧、低氧及再氧合条件下对Hep-2细胞增殖的抑制作用。
　　2流式细胞术检测在不同给氧条件下顺铂对Hep-2细胞和HIF-RNAi-Hep-2细胞周期和细胞凋亡的影响。
　　结果：
　　1 MTT结果：低氧可导致顺铂对Hep-2细胞增殖的抑制作用减弱，当恢复常氧培养后，顺铂对Hep-2细胞增殖的抑制作用逐渐恢复原有水平。HIF基因敲除后，顺铂对Hep-2细胞增殖的抑制作用明显增强，但仍受到低氧的部分影响。
　　2流式细胞术检测结果显示：低氧可导致Hep-2细胞周期分布发生改变，G0/G1期比例增加，S期的细胞比例下降(P<0.05)，细胞凋亡率降低，对化疗的抵抗作用增强。当细胞由低氧恢复常氧培养后再给予顺铂药物干预，细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。HIF-RNAi-Hep-2细胞在低氧条件下对顺铂诱导的细胞凋亡亦具有一定的抵抗作用，但对顺铂的敏感性高于Hep-2细胞，当细胞恢复常氧培养一定时间后，其顺铂诱导的细胞凋亡显著增加(P＜0.05)。
　　结论：低氧可导致Hep-2细胞发生G0/G1期阻滞，凋亡率降低，当细胞恢复常氧培养一定时间后，即细胞乏氧微环境得到改善后，细胞对顺铂作用的敏感性明显提高；HIF基因敲除后，肿瘤细胞对化疗的敏感性增加，但仍受到乏氧微环境的影响，当细胞周围乏氧微环境彻底改善后，顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用极大增强。