活性氧在慢性间歇性低压低氧适应性心脏保护形成中的作用和机制

摘要

近年来，慢性间歇性低压低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)对心脏的保护作用及其机制的研究越来越引起人们的关注，已成为临床医学、航天医学和高原医学等领域的研究热点之一。CIHH的心脏保护作用主要包括抗缺血性损伤，抗心律失常和改善心肌退行性变三个方面。其作用机制可能与促进心肌毛细血管增生、增加冠脉血流量、激活ATP敏感性钾通道、抑制线粒体通透转换孔以及抑制心肌细胞膜肾上腺素能受体活性等因素有关。然而，这些研究均是针对CIHH处理后结果，即CIHH处理的最终效应所进行的。然而，有关CIHH适应性心脏保护作用的形成过程及机制尚未见报道。目前一致的观点认为，活性氧(reactiveoxygen species，ROS)具有保护性或损伤性双重作用，取决于ROS的数量。大量证据表明，ROS在低浓度时表现心脏保护作用，而高浓度时可导致心肌损伤作用。在培养的细胞或者整体动物水平，间歇性低氧均可刺激ROS产生，ROS可以通过介导信号转导机制而参与细胞和机体对间歇性低氧的适应性反应。已有研究证实核转录因子2-硫氧还蛋白1-低氧诱导因子1(Nrf2-Trx1-HIF-1α)信号途径介导由ROS诱导的间歇性低氧反应。但迄今为止，尚不清楚ROS是否参与CIHH适应性心脏保护的形成。
　　本研究旨在利用功能学、药物学、形态学和分子生物学等方法，在清醒动物整体、离体心脏和细胞分子水平动态观测CIHH适应性心脏保护的产生过程，并探讨ROS在其中的作用及其信号转导机制。研究分为以下三个部分：(1)利用生理信号遥测系统在清醒大鼠，动态观测CIHH适应形成过程中心血管活动的变化，并明确ROS在其中的作用。(2)证实Nrf2-Trx1-HIF1α分子途径及其主要的下游信号分子参与CIHH适应性心脏保护的形成，以及ROS在其中的作用。(3)明确CIHH对劲动脉体化学感受器敏感性的影响及ROS在其中的作用。
　　Ⅰ、活性氧参与清醒大鼠慢性间歇性低压低氧适应过程中心血管活动的动态变化
　　目的：CIHH具有心脏保护作用。大量证据表明低氧刺激产生的ROS可作为第二信使激发机体产生各种适应性反应。本研究旨在探讨CIHH适应过程中心血管活动的动态变化，以及ROS所起的作用。
　　方法：雄性SD大鼠随机分为四组：对照组(Control)、间歇性低压低氧处理组(CIHH)、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸处理组(Control+NAC)和应用N-乙酰半胱氨酸同时间歇性低压低氧处理组(CIHH+NAC)。CIHH组大鼠置于低压氧舱，给予42天模拟海拔5000米的低压低氧处理，每天6小时，其余时间处于常氧环境。Control+NAC组大鼠每天同一时间皮下注射NAC(80 mg/kg)。CIHH+NAC组大鼠每天上仓前皮下注射NAC。Control组动物除不接受CIHH及NAC处理外，其余处理与CIHH大鼠相同。利用清醒动物生理信号遥测系统监测和分析大鼠在相应处理过程中平均动脉压(MAP)和心率(HR)的变化。应用ELISA方法测定左心室心肌组织中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GPX)、丙二醛(MDA)、类脂褐素(LFP)、蛋白羰基(PCL)和谷胱甘肽/二硫化谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)以监测心肌的氧化应激水平。
　　结果：
　　(1)CIHH大鼠心肌组织GSH-PX，MDA和LFP增加，GSH/GSSG降低(P<0.05)，说明CIHH可提高心肌氧化应激水平和ROS的产生。
　　(2)CIHH不影响常氧状态下各组动物的MAP。但可以取消HR随年龄的降低(P<0.05)，NAC处理可部分阻断CIHH(P<0.05)这一作用。
　　(3)在低压低氧仓内，CIHH大鼠的MAP和HR出现适应性变化。早期(上仓1小时内)MAP和HR迅速升高达到峰值(P<0.05)，而后逐渐降至最低。后期(上仓2至6小时内)，MAP和HR相对稳定，呈平台水平。随CIHH处理时间的延长，MAP和峰值和平台值逐渐升高，达峰值的时间缩短(P<0.05)。HR的峰值逐渐降低，达峰值时间延长，而其平台值逐渐升高(P<0.05)。NAC处理可部分取消MAP和HR的适应性变化。
　　(4)给予急性常压低氧刺激，CIHH大鼠的MAP和HR升高幅度明显低于Control和Control+NAC组动物(P<0.05)。CIHH的这种抗低氧损伤作用至少可持续两周。NAC处理可部分阻断CIHH的此种作用(P<0.05)。
　　结论：本研究首次在清醒大鼠证实，CIHH过程产生的适量ROS参与CIHH过程中MAP和HR的适应性变化，并参与形成对抗急性低氧损伤的适应性保护机制。这种ROS依赖的适应性保护作用产生至少需要28天的CIHH所激发；而且在CIHH处理结束后，这种保护作用可持续至少两周。
　　Ⅱ、活性氧激活的Nrf2-Trx1-HIF1信号途径参与大鼠慢性间歇性低压低氧适应性心脏保护的形成
　　目的：探讨CIHH适应形成过程中Nrf2-Trx1-HIF1信号途径及其主要下游分子的激活，以及ROS在其中的作用。
　　方法：实验分组和CIHH处理同本研究第一部分。利用Western印迹和免疫组织化学的方法观测左心室心肌组织中Nrf2，Trx1，HIF1α，iNOS，VEGF and EPO的表达。
　　结果：
　　(1)CIHH过程中Nrf2-Trx1-HIF1信号途径被激活。CIHH处理28天后，Nrf2，Trx1，HIF1α表达明显增强(P<0.05)。CIHH大鼠左心室心肌组织中，Nrf2的核转位及Nrf2阳性细胞核数均明显增加(P<0.05)。NAC处理可部分阻断这些效应(P<0.05)。
　　(2)ROS可诱导Nrf2的核转位，即Nrf2的激活。CIHH处理1天后，心肌细胞核中Nrf2的表达明显升高，阳性细胞核数增加(P<0.05)。应用NAC抑制了Nrf2的表达(P<0.05)，Nrf2的激活推迟至CIHH处理2天以后。
　　(3)ROS介导CIHH过程中Nrf2-Trx1-HIF1信号途径的激活。在心肌的全细胞提取物中，Nrf2在CIHH处理的2天后被激活(P<0.05)，Trx1和HIF1在CIHH处理3天后被激活(P<0.05)。应用NAC抑制这些信号分子的表达，并将Nrf2、Trx1和HIF1信号分子激活时间分别推迟至CIHH处理后3天或5天。
　　(4)接受CIHH处理7或14天后，Nrf2-Trx1-HIF1信号途径的下游信号分子iNOS，VEGF和EPO的表达明显提高(P<0.05)。NAC可部分取消CIHH的上述作用(P<0.05)。
　　结论：Nrf2-Trx1-HIF1信号途径及其主要下游分子iNOS，VEGF和EPO在CIHH适应形成过程中被激活。iNOS，VEGF和EPO参与ROS依赖的CIHH适应性心脏保护机制。
　　Ⅲ、慢性间歇性低压低氧通过适应过程中产生的ROS易化颈动脉体化学感受器活动
　　目的：探讨CIHH对颈动脉体化学感觉器敏感性及呼吸频率(respiration frequency，RF)的影响，明确ROS在其中的作用。
　　方法：实验分组和CIHH处理同本研究第一部分。利用生理信号遥测系统记录和分析不同处理过程中清醒动物的呼吸频率变化。采用全神经双根铂丝电极记录法记录颈动脉体窦神经放电活动(carotid sinus nerveactivity，CSNA)。
　　结果：
　　(1)Control组大鼠的RF无明显年龄依赖性变化。各组大鼠的基础RF无统计学差异。
　　(2)在低压低氧仓内，CIHH大鼠的RF出现适应性变化。早期(上仓1小时内)RF迅速升高达到峰值，而后逐渐降至最低(P<0.05)。后期(上仓2至6小时内)，RF相对稳定，呈平台水平。随CIHH处理时间的延长，RF的峰值逐渐降低，达峰值时间延长(P<0.05)，而其平台值逐渐升高(P<0.05)。NAC处理可部分取消RF的适应性变化(P<0.05)。
　　(3)给予急性常压低氧刺激，CIHH大鼠的RF升高幅度明显低于Control和Control+NAC组动物(P<0.05)。CIHH的这种抗低氧损伤作用至少可持续两周(P<0.05)。NAC处理可部分阻断CIHH的此种作用(P<0.05)。
　　(4)与Control组大鼠相比，CIHH大鼠的CSNA对急性常压低氧刺激的反应明显增强(P<0.05)。NAC处理可完全取消CIHH的这一作用(P<0.05)。
　　结论：CIHH可诱导ROS依赖性的RF适应性变化和抗急性低氧效应，这种抗急性低氧损伤作用可以维持至少两周。CIHH增强颈动脉体化学感觉器对低氧的敏感性，这种易化作用是由CIHH适应过程中产生的ROS所介导。