Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用的新靶向—肌成纤维细胞分化和差异蛋白的筛选

摘要

目的：矽肺是一种常见的职业性呼吸系统疾病。在我国，由于工业的快速发展而防护性措施相对不甚完善，尘肺病的发病率仍然很高。到2010年底，我国累计报告了676，541例尘肺病例，每年新增10，000例左右，其中一半以上是矽肺病。矽尘做为潜在的致纤维化因子，可诱导肺泡巨噬细胞的凋亡，并激活巨噬细胞介导的慢性炎症，释放大量酶和细胞因子，如转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)。TGF-β能通过促进胶原合成和其他致纤维化因子表达的上调，以及抑制基质降解来促进细胞外基质的沉积。作为致纤维化的重要细胞因子，TGF-β能够促进成纤维细胞向特异性表达平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的肌成纤维细胞分化，而这一过程受到血清应答因子(serum response factor，SRF)的调控。
　　N-乙酰基-丝氨酰－天冬氨酰－赖氨酰－脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)是一种具有抗组织炎症和抗器官纤维化功能的短肽，可被血管紧张素转换酶特异性水解，使用血管紧张素转换酶抑制剂能够上调血浆中Ac-SDKP的表达。我们和其他课题组发现Ac-SDKP具有抑制器官纤维化(包括心、肾、肺)的功能。前期我们报道了Ac-SDKP能够抑制慢性炎症，下调TGF-β表达及其诱导的成纤维细胞增殖和胶原合成，减轻矽肺大鼠纤维化的程度，具有拮抗矽肺纤维化的作用。
　　本研究拟探讨Ac-SDKP能否通过调控TGF-β及其受体诱导的肌成纤维细胞分化，进而抑制矽肺纤维化的发生、发展。并采用比较蛋白组学技术，筛选出矽肺大鼠肺组织中的特异性差异蛋白以及Ac-SDKP对这些差异蛋白的调节规律。进一步阐明矽肺发生的相关机制，寻找Ac-SDKP抗矽肺纤维化的作用靶点，以期为开发Ac-SDKP作为一种新型的抗器官纤维化的新药提供进一步的理论基础和实验依据。
　　方法：原代培养乳鼠肺成纤维细胞，并分为：1)对照组；2)TGF-β1诱导组；3)TGF-β受体阻断剂组(TGF-β1+LY364947)；4)Ac-SDKP干预组(TGF-β1+Ac-SDKP)。采用支气管一次性灌注二氧化硅(SiO2)粉尘制作大鼠矽肺模型，动物被分为：1)对照4周组；2)矽肺4周组；3)对照8周组；4)矽肺8周组；5)Ac-SDKP抗纤维化治疗组；6)Ac-SDKP预防治疗组。采用免疫组织化学染色、免疫细胞化学染色、Western blot或Realtime PCR等方法检测TGF-β1及其受体、SRF、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白或mRNA的表达。
　　提取肺组织蛋白样品经双向电泳分离，胶体考马斯亮蓝染色显示蛋白点。扫描输入计算机，用ImageMaster6.0图像分析软件对凝胶进行分析，差异蛋白判定标准为：该蛋白点在两组间(对照组4周、8周分别与矽尘4周、8周组比较；Ac-SDKP抗纤维化治疗组与矽尘8周组比较；Ac-SDKP预防治疗组与矽尘组8周比较)有统计学差异(P<0.05)，且volume%值上下变化超过30%。将凝胶中的差异蛋白点切出，经胶内胰蛋白酶解，并行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)获得肽质量指纹谱并对蛋白质进行分析。
　　结果：
　　1 Ac-SDKP对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞TGF-βⅠ型受体、Ⅱ型受体的调节作用
　　TGF-β1能够显著上调肺成纤维细胞TGF-βⅠ型受体、Ⅱ型受体的表达，与对照组相比分别上调1.84和1.94倍。给予TGF-β受体阻断剂LY364947，能够显著减弱TGF-β1的诱导效应。分别为TGF-β1诱导组的63.59%和70.10%。给予Ac-SDKP干预处理，能够显著减少TGF-βⅠ型受体、Ⅱ型受体的表达，分别为TGF-β1诱导组的76.83%和84.92%。
　　2 Ac-SDKP对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞SRF和α-SMA表达的调节作用
　　给予TGF-β1诱导48h后，镜下可见成纤维细胞胞体伸展，呈纺锤形，免疫细胞化学染色可见胞体内大量平行或交叉排列的α-SMA标记的肌丝。给予LY364947和Ac-SDKP干预后，α-SMA阳性表达的肌丝结构显著减少。Western blot结果显示，TGF-β1诱导SRF、α-SMA蛋白的表达上调，分别是对照组的2.65倍和2.00倍。而给予LY364947和Ac-SDKP干预处理后，能够明显下调SRF和α-SMA蛋白的表达。LY364947干预组SRF和α-SMA蛋白表达分别为TGF-β1诱导组的65.28％和66.50％。Ac-SDKP干预组SRF和α-SMA蛋白表达分别为TGF-β1诱导组的50.57％和68.00％。Realtime PCR结果显示，TGF-β1能够显著上调SRF和α-SMAmRNA的表达水平。与对照组比分别上调了2.63倍和2.93倍。给予LY364947和Ac-SDKP干预处理后，能够显著抑制TGF-β1诱导的SRF和α-SMA mRNA的表达。LY364947干预组SRF和α-SMA mRNA表达分别为TGF-β1诱导组的61.24％和49.68％。Ac-SDKP干预组SRF和α-SMAmRNA表达分别为TGF-β1诱导组的58.14％和44.30％。
　　3 Ac-SDKP对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达的调节作用
　　TGF-β1能够显著增加肺成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和mRNA的表达。与对照组比较，分别上调了Ⅰ型和Ⅰ-Ⅱ型胶原蛋白表达的2.11倍和2.15倍。上调了Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的2.11倍和2.15倍。给予TGF-β1受体阻断剂LY364947和Ac-SDKP干预处理后，均能抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和mRNA的表达。LY364947干预组Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达分别为TGF-β1诱导组的65.40％和52.09％，Ac-SDKP干预组Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达分别为TGF-β1诱导组的59.71％和62.33％。
　　4 Ac-SDKP对矽肺大鼠TGF-β1、SRF和α-SMA以及胶原表达的调节作用
　　与对照组比较，矽肺模型组血浆中TGF-β1含量明显上调，矽肺模型组(4周和8周)肺组织中TGF-β1含量分别是相应对照组(4周和8周)的2.55倍和3.22倍。无论是Ac-SDKP抗纤维化治疗组还是预防治疗组，均能有效下调TGF-β1在血浆中的含量水平。分别为矽肺8周组的58.56％和48.14％-Western blot结果显示，矽肺模型组(4周和8周)肺组织中TGF-β1蛋白表达分别是相应对照组(4周和8周)的2.09倍和2.62倍，Ac-SDKP干预治疗(包括抗纤维化治疗和预防治疗)能有效抑制矽肺大鼠肺内TGF-β1蛋白的表达，分别为矽肺8周组的62.26％和38.68％。
　　免疫组织化学染色结果显示，正常对照组中SRF和α-SMA仅在大鼠血管和气管平滑肌细胞中阳性表达，而在矽肺大鼠间质纤维化区域和矽结节中可见较多的SRF和α-SMA阳性表达的细胞，Ac-SDKP干预治疗(包括抗纤维化治疗和预防治疗)时，SRF和α-SMA的染色强度和范围明显减弱。Wester blot结果显示，SRF蛋白在矽肺模型组(4周和8周)中的表达分别是相应对照组(4周和8周)的2.74倍和3.14倍。α-SMA蛋白在矽肺模型组(4周和8周)中的表达分别是相应对照组(4周和8周)的3.11倍和3.13倍，Ac-SDKP干预治疗(包括抗纤维化治疗和预防治疗)时，能够下调SRF蛋白的表达，分别是矽肺模型8周组的54.02％和53.63％。同时下调α-SMA蛋白的表达，分别是矽肺模型8周组的66.96％和63.69％。
　　羟脯氨酸法结果显示，与对照比较，矽肺模型组总胶原含量明显升高，是相应对照组(4周、8周)的1.60倍、1.57倍。给予Ac-SDKP干预治疗，总胶原含量明显减少，其中，Ac-SDKP抗纤维化治疗组总胶原含量是矽肺模型8周组的84.08％，Ac-SDKP预防治疗组总胶原含量是矽肺模型8周组的81.85％。Western blot结果显示，与对照比较，矽肺模型4周组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达增加，分别是对照4周组的1.96倍和2.18倍；矽肺模型8周组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达增加，分别是对照8周组的2.43倍、2.69倍。给予Ac-SDKP干预治疗，Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达减少，其中，Ac-SDKP抗纤维化治疗组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达分别是矽肺模型8周组的59.79％和65.15％。Ac-SDKP预防治疗组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达分别是矽肺模型8周组的55.67％和47.72％。
　　5 Ac-SDKP对矽肺大鼠肺差异蛋白的调节作用
　　经蛋白组学技术筛选出的可溶性差异蛋白点中，与对照4周组相比，矽肺模型4周组有3个蛋白点表达上调，4个蛋白点表达下调。与对照8周组相比，矽肺模型8周组2个蛋白点表达上调，4个蛋白点表达下调。与矽肺模型8周组相比，Ac-SDKP抗纤维化治疗组2个蛋白点表达上调，2个蛋白点表达下调。Ac-SDKP预防治疗组有1个蛋白表达上调，2个蛋白点表达下调。
　　筛选出的难溶性差异蛋白点中，与对照4周组相比，矽肺模型4周组有14个蛋白点表达上调，7个蛋白点表达下调。与对照8周组相比，矽肺模型8周组14个蛋白点表达上调，8个蛋白点表达下调。与矽肺模型8周组相比，Ac-SDKP抗纤维化治疗组3个蛋白点表达上调，4个蛋白点表达下调。Ac-SDKP预防治疗组有7个蛋白表达上调，8个蛋白点表达下调。上述蛋白点表达的差异均具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　1通过体内外的实验模型，Ac-SDKP能够通过阻抑TGF-β及其受体介导的肌成纤维细胞的分化，进而抑制胶原的合成与沉积，发挥了抗矽肺纤维化的作用。
　　2通过蛋白组学技术，筛选到与矽肺纤维化形成和Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用相关的差异蛋白(多涉及调控细胞增殖、凋亡、炎症反应和上皮-间质转化，以及信号转导通路等多方面的功能)。为进一步阐明矽肺的发生机制以及探寻Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用的新靶标提供了重要的科学依据。