豚鼠糖尿病模型的建立和细胞外钾离子浓度对糖尿病豚鼠乳头肌动作电位的影响及其机制的研究

摘要

糖尿病作为常见的代谢性疾病，可引起心律失常，心肌肥厚，心衰等心血管疾病。而这些疾病的发生都与心肌细胞膜上离子通道的重构有关。用四氧嘧啶制备的家兔糖尿病模型，出现QT延长，动作电位时程（APD）延长，与心肌细胞的主要复极电流的密度降低有关，而主要的复极电流为快速延迟整流性钾离子通道电流(Ikr)和缓慢延迟整流性钾离子通道电流(Iks)，Ikr通道蛋白由hERG基因编码，而Iks通道主要由KCNQ1形成的α亚基和KCNE1形成的β亚基组成。当复极电流Ikr和Iks电流密度降低后可使QT和APD延长。本研究旨在观察实验性糖尿病豚鼠乳头肌动作电位的变化及不同浓度的钾离子对糖尿病豚鼠和正常豚鼠乳头肌动作电位的影响并分析其机制。
　　 第一部分豚鼠糖尿病模型的建立
　　 目的:制备豚鼠糖尿病模型。
　　 方法:雄性豚鼠20只，体重250-350g，实验前适应性饲养1周，随机分为2组，对照组和模型组，每组10只，造模前所有豚鼠饥饿12hr。模型组豚鼠快速静脉注射200mg/kg链脲佐菌素(STZ)的枸橼酸缓冲液，对照组注射相同剂量的枸橼酸缓冲液。分别于给药当天（第0天）及给药后第2、7、14天称量体重，并自耳缘静脉取血测量血糖浓度;于给药后14天取各组动物胰腺组织，HE染色后进行病理学观察;采用细胞内玻璃微电极记录的方法观察模型组豚鼠乳头肌动作电位的变化;采用实时定量PCR方法检测模型组豚鼠心肌组织KCNQ1、ERGRNA的变化。
　　 结果:(1)模型组豚鼠出现毛色发暗，身体消瘦，多饮多尿等症状，且有4只豚鼠相继死亡，而对照组动物未见上述表现且全部存活。与对照组相比，给药后第2天，7天，14天模型组豚鼠体重明显减轻(p＜0.01)。(2)给药后第2天，与对照组(6.4±0.6mmol/L)相比，模型组血糖(17.4±1.4mmol/L)明显增加(p＜0.01)，给药后第7天模型组血糖(8.6±1.7mmol/L)与第2天相比有所降低，但与对照组(6.4±0.8mmol/L)相比仍明显增加(p＜0.01)，第14天模型组血糖逐渐恢复，与对照组相比无统计学差异(p＞0.05)。(3)模型组豚鼠胰岛细胞受损，细胞数量明显减少，呈玻璃样变。(4)与对照组(102±12ms)相比，模型组APD30（84±8ms）明显缩短(p＜0.05);与对照组(206±6ms)相比，模型组APD90（168±2ms）明显缩短(p＜0.01);与对照组(104±11ms)相比，模型组APD90-30(84±6ms)明显缩短(p＜0.01);与对照组(20±2v/s)相比，模型组Vmax(16±1v/s)明显减慢(p＜0.01)。(5)与对照组豚鼠心肌ERGRNA(19.63±0.66)相比，模型组豚鼠心肌ERGRNA(5.29±0.15)明显增加(P＜0.01);与对照组豚鼠心肌KCNQ1RNA(3.48±0.08)相比，模型组豚鼠心肌KCNQ1RNA(1.17±0.05)明显增加(P＜0.01)。
　　 结论:豚鼠快速静脉注射200mg/kg链脲佐菌素后，血糖出现可逆性短暂升高。同时出现体重减轻、多饮多尿的症状，与临床Ⅰ型糖尿病相似。此外出现胰岛损伤，APD缩短。因此制备得到豚鼠病理性糖尿病模型。
　　 第二部分细胞外钾离子浓度对糖尿病豚鼠乳头肌动作电位的影响及其机制的研究
　　 目的:观察不同浓度K+对正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳头肌细胞AP的影响并分析其机制。
　　 方法:采用玻璃微电极细胞内记录的方法，观察在1Hz刺激频率作用下改变灌流液中K+浓度（1mM，10mM，30mM），观察其对正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳头肌动作电位参数（APD90，APD30，APD90-30，Vmax，APA）的影响。采用实时定量PCR方法检测糖尿病豚鼠心肌组织孵育1mMK+后KCNQ1、ERGRNA的变化。
　　 结果:(1)1mM钾离子对正常豚鼠心肌细胞AP的影响:与正常台氏液APD30(107±5ms)相比，含1mM钾离子的台氏液灌流30min后APD30(91±4ms)明显减小（P＜0.01）;与正常台氏液APD90(191±6ms)相比，含1mM钾离子的台氏液灌流30min后APD90(246±18ms)明显增大（P＜0.01）;与正常台氏液APD90-30(86±5ms)相比，含1mM钾离子的台氏液灌流30min后APD90-30(155±16ms)明显增大（P＜0.01）;与正常台氏液相比，含1mM钾离子的台氏液灌流30min后Vmax和APA无明显变化（P＞0.05）。(2)1mM钾离子对糖尿病豚鼠心肌细胞AP的影响:与正常台氏液APD90(164±8ms)相比，含1mM钾离子的台氏液灌流30min后APD90(224±14ms)明显延长（P＜0.01）;与正常台氏液APD90-30(68±6ms)相比，含1mM钾离子的台氏液灌流30min后APD90-30(121±25ms)明显增大(P＜0.01);部分乳头肌细胞出现早后除极和触发活动。与正常台氏液相比，含1mM钾离子的台氏液灌流30min后APD30、Vmax和APA无明显变化（P＞0.05）。(3)10mM钾离子对正常豚鼠心肌细胞AP的影响:与正常台氏液APD30(100±9ms)相比，含10mM钾离子的台氏液灌流30min后APD30(69±12ms)明显减小(P＜0.01);与正常台氏液APD90(200±8ms)相比，含10mM钾离子的台氏液灌流30min后APD90(141±10ms)明显减小(P＜0.01);与正常台氏液APD90-30(110±12ms)相比，含10mM钾离子的台氏液灌流30min后APD90-30(68±4ms)明显减小（P＜0.01）;与正常台氏液APA（126±7mV）相比，含10mM钾离子的台氏液灌流30min后APA（109±5mV）明显减慢(P＜0.01);含10mM钾离子的台氏液灌流前后Vmax无明显变化（P＞0.05）。(4)10mM钾离子对糖尿病豚鼠乳头肌的AP的影响:给糖尿病豚鼠乳头肌灌流含10mM钾离子的台氏液30min后APD90（148±11ms）、APD90-APD30（70±5ms）与灌流前APD90（176±6ms）、APD90-APD30（84±7ms）相比明显减小(P＜0.01);其它指标APA、APD30、Vmax在灌流含10mM钾离子的台氏液前后无明显变化(P＞0.05)。(5)30mM钾离子对正常豚鼠心肌细胞AP的影响:用含30mM钾离子的台氏液灌流30min后APA，APD30，APD90，APD90-30，Vmax与灌流前相比均明显减小（P＜0.01）。(6)30mM钾离子对糖尿病豚鼠乳头肌的AP的影响:用含30mM钾离子的台氏液灌流糖尿病豚鼠乳头肌30min后APA，APD30，APD90，APD90-30，Vmax与灌流前相比均明显减小(P＜0.01)。(7)1mM钾离子对糖尿病豚鼠心肌组织中KCNQ1、ERGRNA的影响:用含1mM钾离子的台氏液孵育糖尿病豚鼠心肌组织30min，其KCNQ1、ERGRNA，与糖尿病豚鼠心肌组织相比，明显增加(P＜0.01)。
　　 结论:细胞外不同浓度K+可改变正常豚鼠和糖尿病豚鼠的AP，低浓度K+(1mM)使正常豚鼠和糖尿病豚鼠APD延长，高浓度K+(10mM)使正常豚鼠和糖尿病豚鼠APD缩短。低浓度K+(1mM)使糖尿病豚鼠心肌细胞Ikr和Iks电流密度增加，但APD却缩短。
　　 第三部分细胞外高浓度葡萄糖对豚鼠乳头肌动作电位的影响
　　 目的:观察细胞外100mM葡萄糖对正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳头肌动作电位的影响。
　　 方法:采用玻璃微电极细胞内记录的方法，观察在1Hz刺激频率作用下改变灌流液中葡萄糖浓度(100mM)，观察其对正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳头肌动作电位参数(APD90，APD30，APD90-30，Vmax，APA)的影响。
　　 结果:(1)100mM葡萄糖对正常豚鼠乳头肌细胞AP的影响:与正常台氏液APD90(210±9ms)相比，含100mM葡萄糖的台氏液灌流30min后APD90(196±5ms)明显缩短(P＜0.01);与正常台氏液APD390(120±6ms)相比，含100mM葡萄糖的台氏液灌流30min后APD30(110±7ms)明显缩短（P＜0.05）;含100mM葡萄糖的台氏液灌流30min后APD90-30、Vmax和APA无明显变化（P＞0.05）。(2)100mM葡萄糖对糖尿病豚鼠乳头肌细胞AP的影响:与正常台氏液APD90(166±4ms)相比，含100mM葡萄糖的台氏液灌流30min后APD90(152±5ms)明显缩短(P＜0.01);100mM葡萄糖灌流30min后，APA，APD30，APD90-30，Vmax与灌流前比较，均无显著性差异（P＞0.05）。
　　 结论:100mM葡萄糖可缩短正常豚鼠和糖尿病豚鼠乳头肌细胞APD90。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 豚鼠糖尿病模型的建立

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 细胞外钾离子浓度对糖尿病豚鼠乳头肌动作电位的影响及其机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 细胞外高浓度葡萄糖对豚鼠乳头肌动作电位的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述

致谢

个人简历