C.jejuni毒力及耐药基因的分析和粪便中的C.jejuni快速鉴定

摘要

目的:
　　 1、选取空肠弯曲菌的12对毒力相关基因和8对耐药基因对3株吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)相关空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni，C.J.）及NCTC11168共4种菌株进行相关基因分析和比较，了解致C.jejuni菌株毒力基因及耐药基因性的特征，探讨C.jejuni致GBS机制。
　　 2、传统的对空肠弯曲菌的分离实验是通过传代进行培养，经过形态学鉴定及生化鉴定疑似空肠弯曲菌以后再做分子方面的鉴定实验，至少要花费三天的时间。常见的特异性生化实验马尿酸实验，由于放置的时间的差异会出现假阴性，降低分离率。而分离方法，需要经验丰富的实验员挑取可疑单菌落，经过纯种传代后，一些毒力及耐药性可能因为这种非自然的传代而丧失，影响我们对其分子方面的研究。本次实验旨在模拟从粪便中直接检测出空肠弯曲菌的过程，找出特异性及灵敏度高的检测方法，通过PCR对空肠弯曲菌进行快速而准确的鉴定。
　　 方法:
　　 1、选取空肠弯曲菌的12对毒力相关基因包括:黏附相关基因codF和racR，鞭毛蛋白基因flaA，毒素调节基因cdtA、cdtB、cdtC、wlaN和virB11质粒基因，热休克蛋白和转运相关蛋白基因dnaJ，ceuE，CiaB和pldA基因，8对耐药相关基因包括对环丙沙星耐药gyrA，parC基因，对四环素耐药基因tet(o)，对大环内脂类耐药基因mutation，CJ1/DP1，CJ18/CJ19和CJ20/SJ21，对妥布霉素-庆大霉素耐药基因int1。应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)对菌株的毒力及耐药基因进行扩增，通过扩增出来的条带确定空肠弯曲菌的毒力及耐药基因的差别。
　　 2、利用平板传代法对NC11168菌株传代至P2代，经过生化及分子鉴定;随机收集病区中没有腹泻及吉兰巴雷综合征的患者的新鲜粪便16份，分别置于布氏肉汤中;将肉汤中的粪便振荡分散后，利用滤膜过滤和PBS离心处理;在滤液中加入调整浊度后的NC11168菌液，根据添加菌液浓度的不同进行分组，实验组分五组，分别为103个/ml组，104个/ml组，105个/ml组，106个/ml组及对照组;利用多重PCR及普通PCR对粪便进行检测。
　　 结果:
　　 1、毒力基因flaA，cadF，racR，pldA和cdtB在四种菌株中均可被检测到，cdtA和dnaJ在lulei，lichang，NCTC11168三种菌株中可被检测到。virB11在四种菌株中都没有被检测到，CiaB和cdtC仅在lulei中存在，wlaN基因在lulei，lichang和qiaoyuntao三种菌株中均存在，ceuE在lulei，qiaoyuntao和NCTC11168中可检测到。耐药相关基因中对大环内脂类耐药基因CJ1/DP1，在检测的四株空肠弯曲菌中都被检测到，CJ18/CJ19 lichang，lulei和NCTC11168中检测到，CJ20/CJ21于qiaoyuntao，NCTC11168和lulei中检测到，mutation中没有检测到。环丙沙星耐药基因gyrA和parC在检测的四株空肠弯曲菌中都被检测到。四环素耐药质粒基因tet(o)，只在lichang中检测到。对妥布霉素-庆大霉素耐药基因int1，在qiaoyuntao株中被检测到。
　　 2、多重PCR的结果，在五个分组中，实验组2中的标号为6和8的样本中扩增出一条16S的基因片段，实验组3中编号为9的样本扩增出一条hipo基因片段，实验组4中编号为14的样本扩增出两个条带即16S，hipo的基因片段。利用16S为扩增的目的基因的普通PCR的结果，在五个分组中，实验组1中编号为4的样本扩增出目的条带，实验组2中6和8的样本中扩增出目的条带，实验组3（中编号为9，10，11的样本均扩增出目的条带，实验组4中编号为13，14的样本扩增出目的条带。利用普通PCR对样本进行map基因扩增，各组均没有扩增出目的基因;对目的基因FlaA进行扩增在实验组1中编号4的样本中扩增出目的基因，实验组2中编号为6和8的样本扩增出目的条带，实验组4中编号为13的样本扩增出目的基因。
　　 结论:
　　 1、空肠弯曲菌有着多重调控和监控基因，还有多重的毒力及耐药性。GBS相关的空肠弯曲菌的毒力基因比NCTC11168要多，而且不同的致病菌株间也有很大差异，在致病过程中的粘附，入侵，细胞毒作用和支持作用的基因都各不相同，毒力较强的lulei株在所测的12中毒力基因中所含的毒力基因种类最多。耐药性在致病菌株中同样较NCTC11168种类多，这可能与医源环境有关。有没有可能是不同的菌株是通过不同的机制致病，目前还没有足够的证据证明，但是通过对毒力和耐药基因的研究，的确存在基因的侵染及耐药的不同性。
　　 2、实验中通过蒸煮法获得的DNA用于空肠弯曲菌的身份鉴定，实验结果证明多重PCR并不适用于粪便中的空肠弯曲菌的鉴定，在浓度为106-103中其准确率低于30％，多重PCR在鉴定细菌的过程中对循环体系的组成及温度的要求是相对严格的。在此次实验分别选取三个基因16S，map和flaA基因利用普通PCR的方法对14个样本进行基因扩增，其中16S为的测出率相对较高，阳性率约为81.15％，而对于map基因的扩增没有得到阳性的结果，在flaA基因中12个实验组样本中扩增出4个阳性结果，阳性率约为33.33％。在三个普通PCR的结果中，16S的基因测出率相对较高，而其他的两种基因结果不太理想，但是由于16S的特异性只局限在弯曲菌属，不能对空肠弯曲菌进行身份识别，所以对于弯曲菌中的目的基因的选取上还有很多值得研究的地方。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 空肠弯曲菌的毒力及耐药基因的分析

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 粪便中空肠弯曲菌的快速分离

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 空肠弯曲菌质粒及载体建立的研究及发展

致谢

个人简历