不同PKC亚型对hERG钾通道蛋白表达的影响

摘要

心律失常，尤其是严重的室性心律失常是致心血管病患者死亡的主要原因之一，因此揭示心律失常发生的细胞分子机制是目前国际心血管领域的研究热点。先天遗传基因改变或后天获得性因素引起心肌离子通道的结构和/或功能紊乱是产生心律失常的重要原因。
　　 迄今为止，钾离子通道是在所有心肌离子通道中发现的亚型最多，作用最复杂的一类离子通道。其中，快激活延迟整流钾电流(therapidlyactivatingdelayedrectifierKcurrent，IKr)在维持心肌动作电位的平台期和3期复极期起到重要的作用，IKr通道孔区α亚单位由hERG基因(humanether-a-go-go-relatedgene)编码。先天性hERG基因突变引发离子通道病和心血管疾病状态下（例如高血压、冠心病心肌缺血等）均伴有hERG/IKr钾通道功能异常，其功能的下调是造成获得性LQT综合征的主要原因。LQT常伴各种室性心律失常（尤其是可能引发尖端扭转等致命性心律失常），具有高发心源性猝死(SuddenCardiacDeath，SCD)的危险。因此研究病理状态下hERG/IKr钾通道功能改变机制具有重要意义。
　　 蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是由一类具有Ca2+、磷脂依赖性的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶组成。迄今，已鉴定出至少10种PKC亚型（异构体），依据它们的结构与激活机制分为三类:传统型PKC（cPKC，包括α、βⅠ、βⅡ和γ)，新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ），非典型PKC（aPKC，包括ζ、↓/λ）。已有实验研究表明，PKC是体液因素及神经递质调控hERG/IKr通道功能的重要中介物，在病理情况下神经体液因素上调，通过激活PKC改变hERG/IKr通道功能。
　　 研究发现，在分离的豚鼠心室细胞或转染hERGcDNA的蛙卵细胞上，激动α1A受体可通过PKC及PKA途径介导引起hERG/IKr电流减小，PKC亦介导M3胆碱受体激动引发的hERG/IKr电流的下调。我们课题组前期研究已发现，在急性分离的豚鼠心室肌细胞及异源表达系统中，给予血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对hERG/IKr电流呈现急性抑制作用，短时间给予PMA或OAG直接激活PKC均可下调hERG/IKr电流。上述实验表明，激活PKC对hERG/IKr通道发挥急性抑制作用。然而有文献报道，在稳态转染的hERG-HEK293细胞中，长时间(24h)孵育α1受体激动剂苯肾上腺素(PE)或PMA均可通过PKC途径增加hERG钾通道的蛋白表达。
　　 已知，不同PKC亚型具有不同的下游靶分子从而发挥不同的功能。内皮素-1通过PKCα、而血管紧张素Ⅱ通过PKCε抑制动脉平滑肌细胞中K+电流。慢激活延迟整流钾电流(IKs)可选择性被PKCβⅡ、ε亚型上调，而α、βⅠ、δ亚型对通道功能没有明显影响。至今是否不同PKC亚型具有特异性调控hERG/IKr钾通道的功能尚不清楚。
　　 因此，本研究主要用分子生物学方法，在前期实验研究的基础上在异源表达系统中进一步研究PKC亚型（主要研究心肌中富含的cPKCs和nPKCs中的PKCε亚型）对hERG钾通道蛋白的慢性调节作用。这对理解心肌离子通道的电生理重构机制具重要意义，也将为发现以PKC亚型为靶点的新型抗心律失常药物提供重要的理论依据。
　　 目的:
　　 研究cPKCs和PKCε亚型对hERG钾通道蛋白的慢性调节作用。
　　 方法:
　　 在稳态转染的hERG-HEK293细胞中，分别给予非选择性或选择性PKC亚型的激动剂或激动肽，孵育24h后，提取细胞全蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将蛋白通过电转移至NC膜上，经5％脱脂奶粉封闭液封闭后，加入特异性hERG和GAPDH（内参蛋白）一抗与红色荧光标记的二抗，用Odyssey9120双色红外激光成像系统仪器扫描，用密度分析软件对蛋白条带进行分析，检测hERG钾通道蛋白表达的变化。hERG蛋白的相对含量以hERG蛋白与其GAPDH的灰度值比值表示，并均以对照组的灰度比值为100％，计算出给药后hERG蛋白的相对表达量。实验数据均用OriginPro7.0进行数据分析，采用平均数±标准误表示，n代表实验重复次数。两组间数据比较采用t检验，P＜0.05时认为两组间的差异具有统计学意义。
　　 结果:
　　 (1)非选择性PKC亚型激动剂慢性孵育对hERG钾通道蛋白含量的影响:在稳态转染的hERG-HEK293细胞中孵育PMA（100nM）24h后，westernblot检测到hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白的表达量分别为140.8±3.0％(P＜0.001，n=3)和143.2±5.0％(P＜0.001，n=3)。孵育OAG(10μM)24h后，hERG钾通道成熟蛋白的表达量为和非成熟蛋白的表达量分别为148.0±6.0％(P＜0.001，n=3)和126.5±3.8％(P＜0.001，n=3)。PMA组与OAG组相比，两组对成熟蛋白的作用相近（P＞0.05），对非成熟蛋白而言，OAG组的作用弱于PMA组(P＜0.05)。上述结果表明，非选择性PKC激动剂慢性孵育可增加hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白的表达。
　　 (2)选择性PKC亚型激动剂慢性孵育对hERG钾通道蛋白含量的影响:
　　 首先孵育cPKCs亚型激动剂Ingenol(200nM)24h后，westernblot检测到hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白的表达量分别为143.0±7.3％(P＜0.01，n=3)和145.1±6.9％(P＜0.01，n=3)。接下来孵育选择性PKCε亚型激动剂FR236924(200nM)24h后，hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白的表达量分别为129.7±3.6％(P＜0.001，n=4)和115.8±0.8％(P＜0.001，n=4)。Ingenol组与FR236924组相比，两组对成熟蛋白的作用相近（P＞0.05），对非成熟蛋白而言，FR236924组的作用弱于Ingenol组(P＜0.01)。实验结果提示，在慢性孵育过程中，cPKCs和PKCε均对hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白的表达起上调作用，且cPKCs的作用强于PKCε的作用。
　　 联合给予Ingenol(200nM)和FR236924(200nM)24h后，westernblot检测到hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白的表达量分别为153.8±5.7％(P＜0.001，n=3)和158.9±5.4％(P＜0.001，n=3)。联合给药组与单独给予Ingenol组相比，两组对成熟蛋白和非成熟蛋白的作用相近（均P＞0.05），联合给药组与单独给予FR236924组相比，联合给药组对成熟蛋白和非成熟蛋白的作用均强于FR236924组（P＜0.01或P＜0.001）。实验结果可提示，cPKCs和PKCε可能经相同的下游靶分子对hERG钾通道进行慢性调控，但得出此结论需进行更多的实验研究。
　　 (3)选择性PKC亚型激动肽慢性孵育对hERG钾通道蛋白含量的影响:
　　 分别孵育打孔剂Saponin（200nM），Saponin(200nM)+选择性cPKCs亚型激动肽（200nM），Saponin(200nM)+选择性PKCε亚型激动肽（200nM）24h后，westernblot检测Saponin组对hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白均无影响（均P＞0.05）。与Saponin组相比，cPKCs激动肽组成熟蛋白和非成熟蛋白的表达量分别为138.7±4.5％(P＜0.01，n=3)和120.2±3.2％(P＜0.01，n=3)。PKCε激动肽组成熟蛋白和非成熟蛋白的表达量分别为127.2±0.4％(P＜0.01，n=3)和116.6±1.6％(P＜0.01，n=3)。cPKCs激动肽组与PKCε激动肽组相比，cPKCs激动肽组对成熟蛋白的作用强于PKCε激动肽组（P＜0.05）。结果表明，在慢性孵育过程中，cPKCs和PKCε均对hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白的表达起上调作用，且cPKCs的作用强于PKCε的作用。其结果与单独给予PKC亚型激动剂的结果相一致。
　　 联合给予Saponin（200nM）+选择性cPKCs亚型激动肽(200nM)+选择性PKCε亚型激动肽(200nM)24h后，westernblot检测到Saponin组对hERG钾通道成熟蛋白和非成熟蛋白均无影响（均P＞0.05）。与Saponin组相比，联合给药组成熟蛋白和非成熟蛋白的表达量分别为139.3±1.8％(P＜0.001，n=3)和124.5±2.4％(P＜0.001，n=3)。联合给药组与单独给予cPKCs激动肽组相比，两组对成熟蛋白和非成熟蛋白的作用相近（均P＞0.05），联合给药组与单独给予PKCε激动肽组相比，联合给药组对成熟蛋白和非成熟蛋白的作用均强于PKCε激动肽组(P＜0.01或P＜0.05)。实验结果可提示，cPKCs和PKCε可能经相同的下游靶分子对hERG钾通道进行慢性调控，其结果与联合给予PKC亚型激动剂的结果相一致。
　　 结论:
　　 (1)在异源表达系统上，慢性激活PKC可明显增加hERG钾通道蛋白的表达。
　　 (2)选择性激活cPKCs和PKCε均对hERG钾通道蛋白表达起上调作用，且cPKCs的作用强于PKCε的作用。

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