玻璃化法与化学萃取制备同种异体肌腱生物学性能的比较

摘要

目的:肌腱缺损在临床中是最为多见的手外伤疾病，在其治疗过程中常常需要利用异体肌腱移植来修复其不同程度的缺损，以重建失去的重要功能，最大程度地改善症状和恢复功能。目前对于不同程度的肌腱缺损来说可用于移植修复的材料多种多样，根据不同的制备方法可分为自体肌腱、异体肌腱及组织工程化肌腱等，其修复方法中常用的有自体肌腱（转位、延长及自体筋膜）和异体肌腱移植等。传统方法因取材来源有限，增加新的创伤及影响取材位的主要功能等缺点，不能同时满足较严重的肌腱缺损，使人们不断探索肌腱制备的新途径，为肌腱缺损的治疗康复提供新思路。自上世纪50年代以来，对异体肌腱的深入研究发展迅速，已取得了丰硕的成果，异体肌腱移植已经成为目前治疗肌腱缺损的主要方法，但是同时具有生物活性好、力学性能强，免疫原性低等优点的异体肌腱是其需要解决的重点难点，移植后肌腱粘连重、力学性能弱和免疫排斥反应强烈等问题都可致其失败。有关学者们已研究表明肌腱的抗原性主要存在于其肌腱细胞的胞膜上而肌腱的胶原纤维本身抗原性较低，如何去除免疫排斥反应、防止肌腱粘连和保留移植物的相关生物学性能等问题是今后研究的重点。本实验以来亨鸡为实验取材对象，利用玻璃化法与化学萃取法制备同种异体肌腱，通过形态组织学观察、生物力学测试和免疫原性（外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞计数和CD4+/CD8+的比值）检测等三方面指标进行分析、探讨玻璃化法与化学萃取制备同种异体肌腱间的相关生物学性能，以期制备出较为理想的同种异体肌腱，为同种异体肌腱的制备及移植进一步提供有利的理论支持及临床指导。
　　 方法:本实验选取同批孵出、同条件饲养6个月龄体重(2.0～2.2)Kg，平均(2.10±0.053)Kg的健康雄性白色来亨鸡48只（由河北医大动物实验中心提供），经编号及标记处理随机分为三组即A（玻璃化法组）、B（化学萃取组）和C（空白对照组）三组，每组共16只。实验采用来亨鸡双足第三足趾为手术实验趾，于动物大腿肌肉中上部位注射1.0％的氯胺酮（15.0mg/kg）及地西泮（1.0mg/kg），待动物麻醉后将来亨鸡双下肢外展俯卧位固定，进行消毒铺单用橡皮条止血后行手术。手术过程即在掌侧取Bruner's切口，切开皮肤后充分钝性游离出屈趾浅深肌腱及腱纽，将两腱纽于肌腱连接处横断取下从第一趾间关节近端到趾尖处长约5.0cm的趾深屈肌腱，将离断肌腱经反复冲洗去除其外膜后置于D-Hank's液(4℃)冰箱中冷藏备用。对经过三种不同方法（玻璃化法、化学萃取和空白对照）制备的肌腱标本行Ⅰ形态组织学观察:分别在大体观察和光镜观察（HE、Masson染色）等方面进行形态学观察分析;Ⅱ生物力学测试:用生物力学试验机(CSS-44020)对三组肌腱分别行拉伸断裂强度(Pmax)、拉伸断裂功耗(Wmax)和拉伸断裂延伸率(δmax)测定;Ⅲ免疫原性检测:经流式细胞仪检测外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例并计算CD4+/CD8+比值（将处理过的A、B、C三组肌腱两两组合分别移植回同种异体动物体中，于1、2、3、6周末抽取外周血进行检测）。
　　 结果:(1)形态组织学观察:①大体上，空白对照组的肌腱是长索状乳白色肌腱组织，质地柔软表面较光滑，弹性韧性较良好，所有检测肌腱均完整无缺损，三组之间未见明显差别。②光镜观察，空白对照组肌腱腱细胞沿胶原纤维四周呈串珠状纵向分布排列，数根胶原纤维紧密地相连呈束状排列。玻璃化法组肌腱可见少许胶原纤维有断裂迹象，胶原纤维之间间隙较空白对照组略增宽，腱细胞数与空白对照组相比略少。化学萃取组肌腱胶原纤维间间隙较玻璃化组稍宽，胶原纤维存在少许断裂，未见细胞残留迹象;
　　 (2)生物力学检测:三组之间差异无统计学意义，表明三组之间未见明显差异（P＞0.05），说明两种方法均较好地保存了肌腱的生物力学性能;(3)免疫原性检测，三组之间1、2周末CD4+、CD8+T淋巴细胞含量及CD4+/CD8+的比值差异有统计学意义，三组之间差异有显著性(P＜0.05);3、6周末A、B组间CD4+、CD8+T淋巴细胞含量及CD4+/CD8+的比值差异无统计学意义，A、B组的含量及比值均低于C组，表明AB两种方法间未见明显差异(P＞0.05)，AC、BC组间差异有显著性(P＜0.05)，说明玻璃化法和化学萃取法明显降低或去除了肌腱免疫原性，减轻甚至避免了移植后免疫排斥反应的发生。
　　 结论:1、玻璃化法较化学萃取法制备的肌腱保留了原有的肌腱细胞;2、玻璃化法和化学萃取法制备的肌腱明显降低或去除了肌腱的免疫原性，均保留了良好的生物力学性能。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 肌腱的制备

3 实验步骤

4 观察指标

5 统计学方法

结果

(一)形态组织学观察

(二)生物力学检测

(三)免疫原性检测

附图

附表

讨论

1 组织形态学间的比较

2 生物力学性能的比较

3 肌腱免疫原性的比较

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历