NLRP3炎症小体在肝纤维化大鼠肝组织中的表达及其作用机制

摘要

肝纤维化是对各种原因导致的慢性肝脏损伤的一种损伤愈合应答反应，如果持续存在将导致肝功能衰竭，肝硬化甚至肝癌。肝星状细胞的活化，各种致炎因子的释放，并最终导致各种细胞外基质包括胶原、蛋白多糖、糖粘连蛋白等过度沉积在肝纤维化发生过程中起到关键作用。由于肝纤维化是一个可逆的过程，因此，寻求新的生物标记物及有效的治疗靶点，将有助于肝纤维化的预防及逆转，最大限度的避免各种严重后果的发生。
　　 固有免疫是机体第一道屏障系统，对外来病原体的清除和诱导机体产生有效地免疫应答反应发挥重要组成作用，固有免疫通过模式识别系统(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMP)，NOD样受体(NLR)属于PRRs，既能够识别病原相关分子模式（PAMP），也能够识别损伤相关分子模式(DAMP)部分NOD样受体激活后，可以形成巨大的蛋白复合体即炎症小体。根据不同的N端结构域，又可以将NLR家族分为CIITA、NOD、NLRP及IPAF/NAIP等4个亚家族。NLRP亚家族有NLRP1～NLRP14等14个成员，NLRP分子激活后与衔接分子ASC(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD)及效应分子pro-caspase-1形成炎症小体。炎症小体是固有免疫的重要组成部分，在机体免疫和疾病发生过程中起到重要作用，能够识别各种危险信号，通过诱导细胞活化、细胞因子及炎症介质释放，引起炎症反应。由于能被多种类型的病原体或危险信号所激活，炎症小体在多种疾病过程中都发挥了关键作用。NLRP3炎症小体是目前研究最多的一种炎症小体，作为半胱氨酸蛋白激酶1(caspase-1-)的活化分子平台，当感知到各种危险信号存在时，炎症小体便会聚集并并裂解caspase-1前体形成其活化形式，继而活化的caspase-1以蛋白水解的方式裂解炎症介质pro-IL-1β和pro-IL-1成其成熟状态，并分泌到细胞外。随着研究的逐渐深入，人们发现NLRP3炎症小体与多种组织包括肺，肝脏，皮肤的胶原沉积有很大关系。而Watanabeetal的研究表明，炎症小体激活剂MSU能提高体外培养的肝星状细胞中TGF-β1和一型胶原的表达，诱导肌动蛋白的重组，提示其可能与诱导星状细胞活化从而促进肝纤维化发生有关，但作用机制尚不明确。
　　 本课题拟通过BDL（胆总管结扎）的方法造成大鼠肝纤维化模型，通过检测组成成分NLRP3及ASC表达水平，探讨BDL介导大鼠肝纤维化组织中NLRP3炎症小体的表达情况。并通过检测其下游caspase-1活性及IL-1等炎症因子表达情况，探讨NLRP3参与肝纤维化过程的可能机制，从而为肝纤维化的发病机制和有效治疗提供理论依据。
　　 目的:探讨大鼠肝纤维化组织中NLRP3炎症小体的表达情况并探讨NLRP3参与肝纤维化发生过程的可能机制，从而为肝纤维化的发病机制和有效治疗提供理论依据。
　　 方法:采用成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，随机分成正常对照组(简称N)6只、假手术组（简称S）6只，BDL手术组（简称B，分为B1，B2，B3组，分别于术后1w，2w，3w取肝脏组织，每组8只）。运用BDL方法建立大鼠肝纤维化模型，模型组分别于术后1wk、2wk、3wk取材，假手术组与术后3w取材。组织切片经HE和天狼星红，Masson三色染色检测模型建立过程中的动态病理变化;测定血清ALT、AST、胆红素含量;羟脯氨酸试剂盒检测羟脯氨酸含量;WesternBlot方法检测A-SMA，ASC在肝组织的表达;免疫组织化学方法检测NLRP3，ASC的表达;caspase-1活性试剂盒检测caspase-1的活性;ELISA法检测活性IL-1β和活性IL-18表达情况。
　　 结果:①HE染色和天狼星红，Masson三色染色结果证明BDL诱导的大鼠肝纤维化模型建立成功。BDL模型肝脏可见胆管增生明显，大量胶原沉积在小胆管周围，肝脏广泛纤维结缔组织增生包绕分割肝小叶形成假小叶。手术组大鼠于造模3w血清ALT、AST、胆红素及肝脏组织羟脯氨酸含量均较正常对照组及假手术组明显升高（P＜0.05）;②肝组织中有NLRP3，ASC的表达，且在手术组B1～B3组中NLRP3，ASC表达逐渐升高且高于正常对照组及假手术组(P＜0.05);③在BDL诱导的大鼠肝纤维化模型中，caspase-1活性明显该高于假手术组及正常对照组(P＜0.05);④在BDL诱导的大鼠肝纤维化模型中，活性IL-1β和活性IL-18表达明显高于假手术组及正常对照组(P＜0.05)。
　　 结论:在BDL诱导的肝纤维化大鼠的肝脏组织中，NLRP3炎症小体以及其下游分子caspase-1活性升高，IL-1β，IL-18表达升高，说明其可能促进肝纤维化的发生，其作用机制既可能是通过IL-1β，IL-18等炎症因子发挥作用，也可能是直接通过caspase-1直接参与肝细胞凋亡实现的，利用转基因鼠和特异性抑制剂有助于进一步明确，从而为肝纤维化的靶向治疗提供分子依据。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 主要试剂的配制

3 实验过程

4 统计学处理

结果

1 BDL诱导的大鼠肝纤维化模型建立成功

2 BDL模型大鼠肝功能损伤

3 羟脯氨酸含量测定

4 免疫组织化学法检测NLRP3，ASC的表达

5 Western blot检测a-SMA、ASC的表达

6 Casepase-1活性检测

7 ELISA检测血清IL-1β，IL-18

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历