红景天苷经HIF-1α信号通路调节成骨细胞表型表达的研究

摘要

目的:研究已证实藏药红景天具有抗缺氧、促血管新生及抗骨质疏松等多种药理作用，并能够显著促进原代培养的大鼠成骨细胞增殖和分化。但有关常氧和低氧状态下红景天苷(salidroside，SAL)对人成骨样细胞表型表达的调控作用及相关信号通路的研究尚未见报道。本工作在文献报道和前期研究的基础上，以人成骨样细胞MG-63及新生大鼠颅骨成骨细胞(rat osteoblastic cell，ROB)为研究模型，研究常氧和低氧状态下SAL对成骨细胞低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)信号通路的调控作用，并观察了SAL对成骨细胞表型表达的调控作用，对其可能的作用机制进行了初步探讨。
　　 方法:
　　 1、MTT法观察SAL对人成骨样细胞MG-63细胞的增殖能力的影响。
　　 2、采用Annexin V/PI双染法结合流式细胞仪分析在低氧条件下SAL对成骨细胞凋亡功能的影响。
　　 3、采用磷酸苯二钠法应用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测定试剂盒检测SAL对MG-63细胞分化的早期标志性基因ALP活性的影响。
　　 4、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)检测HIF-1α、血管内皮生长因子(vescular endothelial growth factor，VEGF)、骨钙素（osteocalcin，OC）、抑癌基因VHL蛋白（von hippel-lindau protein，pVHL）、Osterix、Runx2 mRNA的表达水平。
　　 5、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA)法检测VEGF以及OC的表达水平和Ⅰ型胶原的含量。
　　 6、免疫印迹(Western Blot)技术检测HIF-1α、pVHL、Osterix、Runx2蛋白的表达水平。
　　 7、采用免疫荧光共聚焦显微镜技术观察SAL对人成骨样MG-63细胞内HIF-1α的核转位调控作用。
　　 8、采用茜素红染色和定量分析法研究SAL对ROB矿化的调控作用。
　　 结果:
　　 1、在低氧和常氧条件下SAL可显著促进人成骨样MG-63细胞增殖。
　　 2、在低氧和常氧条件下SAL可通过增加MG-63细胞中ALP活性、Ⅰ型胶原及骨钙素含量促进成骨细胞分化成熟。
　　 3、低氧可导致MG-63细胞凋亡率显著增加，使用SAL预处理后可显著抑制由低氧诱导的MG-63细胞发生凋亡。
　　 4、常氧状态下，SAL显著促进HIF-1α、VEGF的表达，降低pVHL的表达量;与正常对照组相比，低氧组HIF-1α及VEGF的mRNA及蛋白水平显著增加，pVHL的mRNA及蛋白水平显著降低，与低氧组相比，SAL预处理组HIF-1α的mRNA及蛋白水平显著降低，pVHL及VEGF的mRNA及蛋白水平显著上调。
　　 5、在常氧条件下，HIF-1α在细胞核及胞质中表达量极少，低氧处理后，HIF-1α入核，并在细胞核中大量表达，SAL预处理后与低氧组相比，HIF-1α表达量有所降低。
　　 6、常氧状态下，SAL能显著促进Osterix、Runx2的表达;与正常对照组相比，低氧可导致MG-63细胞特异性转录因子Osterix、Runx2的mRNA及蛋白水平显著下降，与低氧组相比，SAL预处理组Osterix、Runx2的mRNA及蛋白水平显著增加。
　　 7、常氧状态下，SAL能够促进ROB形成矿化结节;低氧处理后，形成矿化结节的数量减少，SAL预处理后，矿化结节的数量较低氧组增加。
　　 结论:
　　 1、在低氧和常氧条件下，SAL对成骨细胞的增殖、分化及矿化有明显的促进作用，同时还对低氧诱导的细胞凋亡有抑制作用。
　　 2、SAL能够减轻低氧对成骨细胞的损伤，促进成骨细胞的表型表达，这种保护作用的机制可能是通过调节HIF-1α信号通路实现的。

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