头部浅低温对全脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体通透性转换孔及细胞调亡的影响

摘要

目的:本实验通过四血管阻断法制备大鼠全脑缺血再灌注模型，在此基础上运用鼻咽腔降温法对大鼠进行头部浅低温，并应用线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放剂苍术苷在大鼠全脑缺血前进行侧脑室注射，来观察再灌注期间大鼠海马MPTP的开放情况，海马CA1区细胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)蛋白、 Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达。研究头部浅低温对全脑缺血再灌注损伤大鼠MPTP及细胞凋亡的影响，进一步探讨浅低温脑保护的作用机制，为以后临床治疗脑缺血再灌注损伤疾病提供新的理论依据。
　　方法:
　　1、实验分组
　　体重250～300g的健康雄性清结级SD大鼠72只（由河北医科大学实验动物中心供应）。将大鼠随机分成6组(n=12):假手术组（S组）、全脑缺血/再灌注组(IR组)、低温组（H组）、苍术苷组（A组）、低温+苍术苷组(HA组)、低温+生理盐水组（HN组）。
　　2、全脑缺血再灌注模型制备
　　制备大鼠全脑缺血再灌注模型应用的是改良的Pulsinelli四血管阻断法。大鼠常规禁食8小时，无需禁水，称重后10％水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉成功后俯卧固定于动物实验台，于颈后正中第一、二颈椎处剪毛消毒后切开皮肤，逐层分离，暴露双侧翼小孔。用自制电烙铁烧灼两侧翼小孔内椎动脉使其永久闭塞，缝合皮肤。24 h后相同方法麻醉大鼠，仰卧固定于实验台上，气管插管保留自主呼吸吸氧，颈前正中剪毛消毒切开皮肤，分离双侧颈总动脉，穿线备用。此过程中，大鼠间断吸入七氟醚维持麻醉，尾静脉穿刺置管持续泵入乳酸钠林格氏液维持循环。
　　3、实验处理及监测
　　大鼠全脑缺血时间为15min，再灌注24 h。不同组给予不同处理:
　　S组作为假手术组只暴露双侧翼小孔，不烧灼椎动脉;只分离颈总动脉，不对其夹闭。其它五组都烧灼椎动脉夹闭颈总动脉，制成全脑缺血再灌注模型。其中，H组、HA组和HN组进行低温处理:在大鼠气管插管后，咽喉部气管插管旁置入棉球和吸痰管（低温过程中持续吸引）以防止误吸，双侧鼻腔置入20G硅胶管，深度约为20 mm，持续泵入4-5℃的冷盐水，速度为100 ml·min-1·kg-1，实施头部浅低温，等到海马温度降至（33.0±0.5）℃后，双侧颈总动脉闭塞15 min，低温维持1h后保持自然复温。HA组和A组于再灌注前10 min苍术苷15 ul左侧脑室缓慢注射。HN组左侧脑室注射等量生理盐水。术中监测脑电图（头皮刺入电极）、心电图（四肢皮下刺入电极）、海马温度（温度探头置入右侧海马CA1区即前囟后3.6 mm、中线右旁开3 mm和皮层下2 mm）以及直肠温度（维持在37.0±0.5℃）。
　　4、标本制备及检测
　　4.1紫分光光度仪检测海马MPTP开放情况
　　再灌注24 h后，每组取6只大鼠进行麻醉（10％水合氯醛腹腔注射），然后迅速断头分离出海马组织，根据线粒体提取试剂盒说明提取海马线粒体，整个过程均在0～4℃下完成。提出的线粒体用于MPTP开放情况的检测。
　　4.2免疫组织化学法测定海马CA1区Cyt C蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达
　　每组取另外6只大鼠麻醉成功后，用4％多聚甲醛迅速经心灌流固定，固定后快速断头取出脑组织并继续固定于4％多聚甲醛中，然后放入4℃冰箱中保存，用于免疫组织化学检测。
　　结果:
　　1、六组大鼠体重比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2、大鼠海马神经元MPTP开放程度的比较
　　与S组相比，其余各组MPTP吸光值减少程度均增大，MPTP开放程度增加(P＜0.05);与IR组比，H组、HA组和HN组MPTP吸光值减少程度降低，MPTP开放程度减小(P＜0.05);与H组比较，HA组MPTP吸光值减少程度增加，MPTP开放程度增加(P＜0.05)。
　　3、大鼠海马CA1区Cyt C蛋白的比较
　　与S组相比，其余五组Cyt C蛋白表达均增多(P＜0.05);与IR组相比，H组、HN组和HA组Cyt C蛋白表达均减少(P＜0.05);与H组相比，HA组Cyt C蛋白表达增多(P＜0.05)。H组和HN组、IR组和A组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　4、大鼠海马CA1区Bax、 Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax的比较
　　与S组比较，其它五组Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达均增加，H组和HN组Bcl-2/Bax比值升高，IR组和A组Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.05);与IR组比较，H组和HN组Bcl-2蛋白表达增加、Bax蛋白表达减少、Bcl-2/Bax比值升高(P＜0.05);与H组和HN组比较，HA组Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白表达增多、Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.05)。H组和HN组比较、IR组和A组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论:
　　1、头部浅低温可有效减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤，抑制细胞凋亡，有神经保护作用。
　　2、头部浅低温的脑保护作用机制与抑制海马细胞MPTP的开放有关。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 主要实验仪器

2 实验试剂及试剂的配置

3 实验动物及实验分组

4 动物模型及各组处理

5 标本采集

6 观察指标及方法

7．统计学分析

结果

1 五组间大鼠的体重比较差异无统计学意义(P>0．05)

2 大鼠海马神经元MPTP开放程度的比较

3 大鼠海马CA1区Cyt C蛋白的比较

4 大鼠海马CA1区Bax、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2／Bax的比较

附图

附表

讨论

1 头部浅低温的的选择

2 制各全脑缺血再灌注模型方法的选择

3 头部浅低温通过抑制MPTP的开放减轻脑缺血再灌注损伤

4 本研究对Cyt C蛋白表达的影响

5 本研究对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

结论

参考文献

综述 线粒体膜通透性转换与缺血再灌注损伤

致谢

个人简历