Rho激酶抑制剂Fasudil对Kv7钾通道选择性调节作用的研究

摘要

电压门控型Kv7(Kv7.1-7.5)钾通道家族由KCNQ基因编码，在调节心肌动作电位及稳定神经元膜电位方面发挥重要作用。Kv7.1通道主要表达于心肌组织，并与其辅助亚单位KCNE1通道共同编码组成延迟整流钾通道(IKs)，在调节心肌细胞动作电位时程中发挥着重要作用，KCNQ1/KCNE1突变体构成遗传性心律失常的基础并导致长QT综合症。Kv7.2和Kv7.3通道以四聚体形式共表达产生的电流已经被证实是M电流分子基础。另有研究发现Kv7.5通道也参与M电流的形成。Kv7.2和Kv7.3通道基因突变或M通道功能失调，可引发许多中枢性疾病，如良性家族性新生儿惊厥症(BFNC)。Kv7.4通道主要表达于内耳的耳蜗和前庭器官以及中枢听觉传导通路。Kv7.4通道突变被证实引发遗传性耳聋症(DFNA2)。近期研究发现Kv7.1、Kv7.4、Kv7.5通道高表达于血管平滑肌等多种平滑肌细胞。药理学研究显示Kv7.1对血管张力无影响，Kv7.4、Kv7.5参与血管张力的调节，Kv7.4、Kv7.5调节剂对高血压存在潜在的治疗价值。但是目前高选择性的Kv7.4、Kv7.5调节剂尚未见报道。本研究发现Rho激酶抑制剂法舒地尔(Fasudil)可选择性激活Kv7.4/Kv7.5通道，而对其它Kv7通道无作用。
　　Fasudil，又名HA1077，是一种新型异喹啉磺酰胺衍生物类Rho激酶(Rho-kinase)选择性抑制药，能强效扩血管，可以有效缓解脑血管痉挛，临床上主要用于改善和预防蛛网膜下腔出血后引起的脑血管病，脑血管痉挛及肺动脉高压的治疗。研究认为Fasudil的血管舒张作用与抑制Rho激酶有关，而我们认为Fasudil的扩血管作用还与增大Kv7钾电流有关。此外，我们发现Fasudil对Kv7钾离子通道家族的调节作用具有选择性。
　　本论文以Kv7钾离子通道家族为出发点，利用电生理穿孔膜片钳技术及四通道微血管张力测定系统，研究Fasudil对表达于HEK293细胞的Kv7钾离子通道、分离培养的乳大鼠的小直径背根神经节(DRG)神经元细胞M通道的作用以及Fasudil对肠系膜阻力血管的作用。
　　1.Fasudil对表达于HEK293细胞的Kv7钾离子通道的作用
　　目的:研究Fasudil对Kv7.1/KCNE1、Kv7.2、Kv7.2/Kv7.3、Kv7.4及Kv7.5的选择性调节作用。
　　方法:利用电生理穿孔膜片钳技术，观察Fasudil对表达于HEK293细胞的Kv7钾离子通道的作用。瑞替加滨(Retigabine，RTG，Kv7钾离子通道开放剂)为阳性对照药。
　　结果:(1)30μM Fasudil对Kv7.1/KCNE1电流无明显作用。
　　(2)1μM、3μM、10μM、30μM及100μM Fasudil对Kv7.2及Kv7.2/7.3电流均无明显作用。
　　(3) Fasudil可浓度依赖性地增强Kv7.4电流，10μM、30μM、100μMFasudil及10μMRTG分别使尾电流增加0.82、1.38、2.03及3.16倍。
　　(4) Fasudil可浓度依赖性地增强Kv7.5电流。Fasudil使电导-电压(G-V)激活曲线左移，且左移的幅度随浓度升高而增大。30μM Fasudil使G-V曲线由-53.7 mV左移至-62.4 mV，左移幅度为9.39±1.10 mV;10μM RTG使曲线左移至-68.9 mV，左移幅度为13.925±1.80 mV。
　　结论:Fasudil对Kv7.4及Kv7.5电流有增大作用，而对Kv7.1/KCNE1、Kv7.2及Kv7.2/7.3电流无明显作用，说明Fasudil对Kv7钾电流的调节作用具有选择性。
　　2.Fasudil对大鼠的小直径背根神经节(DRG)神经元细胞上M电流的作用
　　目的:研究Fasudil对分离培养的大鼠的DRG神经元M电流的影响。
　　方法:利用电生理穿孔膜片钳技术，观察Fasudil对分离培养的大鼠DRG神经元细胞M型钾电流的作用。
　　结果:(1)1μM、3μM、10μM、30μM及100μM Fasudil对大鼠DRG神经元上表达的M型钾电流无明显作用。
　　(2)1μM、3μM、10μM、30μM及100μM Fasudil对大鼠DRG神经元的静息膜电位无明显作用。
　　结论:Fasudil对大鼠DRG神经元细胞上M电流和静息膜电位均无明显作用，提示Fasudil对Kv7.2/Kv7.3无明显作用。
　　3.Fasudil对离体大鼠肠系膜二级阻力血管的作用
　　目的:研究Fasudil对离体大鼠肠系膜二级阻力血管的作用及机制。
　　方法:利用微血管张力测定技术，观察Fasudil对离体大鼠肠系膜二级阻力血管的作用。每次实验分为两小组。Fasudil组:10μM Phe预收缩血管，待平稳之后，依次加入不同浓度的Fasudil，记录实验结果;Fasudil+XE991组:10μMPhe预收缩平稳之后，加入10μM XE991(Kv7钾离子通道阻断剂)孵育15 min，再依次加入不同浓度的Fasudil，记录实验结果。
　　结果: Fasudil可浓度依赖性地舒张Phe预收缩的肠系膜二级阻力血管，EC50为0.83±0.25μM，晟大舒张率(Emax)为96.12％; Fasudil可浓度依赖性地舒张Phe+XE991预收缩的肠系膜二级阻力血管，量效曲线右移，ECs0为5.04±0.96μM，Emax为96.46％。
　　结论:Fasudil舒张Phe+XE991预收缩的血管的量效曲线发生了右移，其机制可能是Fasudil增大了血管平滑肌细胞上Kv7.4及Kv7.5钾电流，使血管舒张。提示Fasudil对Kv7.4及Kv7.5的选择性调节作用是其舒张血管作用的机制之一。
　　以上研究结果表明，Fasudil对Kv7钾通道具有选择性调节作用，为选择性的Kv7钾离子通道调节剂的开发提供了新的思路;另外，Fasudil对Kv7.4和Kv7.5钾电流的增大作用可能是其血管调节的作用机制之一，对其临床应用提供了新的理论依据。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 仪器、药品和实验动物

2 实验方法

结果

1．Fasudil对表达于HEK293细胞的Kv7钾电流的作用

2．Fasudil对大鼠DRG神经元细胞的M电流的作用

3．Fasudil对肠系膜二级阻力血管的舒张性作用

附图

讨论

结论

参考文献

综述 Rho／Rho激酶信号通路对血管的调节作用

致谢

个人简历