鳖甲煎丸抗大鼠肝纤维化作用及对Ⅳ型胶原和胰岛素样生长因子结合蛋白7的影响

摘要

目的:肝纤维化（Hepatic fibrosis，HF）是机体对各种致病因素引起的肝脏慢性损伤的代偿性修复反应，是各种慢性肝病发展为肝硬化过程中共同的病理途径，其特点是肝脏内弥漫性细胞外基质(Extra-cellularmatrix，ECM)的过度增生与沉积。及时治疗阻断肝纤维化能够降低肝硬化的发生几率。近年来研究显示，中医药在肝纤维化的治疗中有一定的优势。化瘀通络中药鳖甲煎丸出自东汉张仲景《金匾要略》，具有消痞化积、活血化瘀、疏肝解郁的功效，可多途径、多靶点作用于抗肝纤维化的治疗。本实验应用鳖甲煎丸对通过四氯化碳(CCl4)诱导建立的肝纤维化大鼠模型进行干预，观察大鼠模型的一般情况，检测大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)的含量，测定其层粘连蛋白(LN)水平，进行肝脏病理学形态观察，检测大鼠肝组织中胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)mRNA及其蛋白表达，探讨化瘀通络中药对肝纤维化的治疗及其可能作用机制。
　　方法:河北医科大学动物实验中心提供清洁级健康雄性SD大鼠56只，体重在330g至410g之间，将其适应性饲养1周，然后随机分成6组，分别为正常对照组(A)、模型组(B)、西药秋水仙碱组(C)、化瘀通络中药鳖甲煎丸低剂量组(D)、鳖甲煎丸中剂量组(E)和鳖甲煎丸高剂量组(F)。A组大鼠皮下注射橄榄油，其余各组大鼠皮下注射含40％CCl4橄榄油溶液，每周2次，实验第1天，每只大鼠按5ml/kg注射，此后每次每只大鼠按3ml/kg注射。同时D、E、F各组大鼠每日分别按中药鳖甲煎丸0.55g/(kg.d)、1.1g/(kg.d)、2.2g/(kg.d)给予10mL/(kg.d)相应药液灌胃，C组大鼠每日按秋水仙碱0.1mg/(kg.d)给予10mL/(kg.d)灌胃，A、B两组大鼠每日分别给予等量蒸馏水灌胃。在实验第6周造模成功后，停止橄榄油或CCl4皮下注射，实验各组大鼠继续给予原剂量药液或蒸馏水灌胃5周，每日1次。在实验第11周末，给予各组大鼠禁食12h，应用水合氯醛将其逐一麻醉，从心脏穿刺取血，离心分离后取血清，分别测定各组大鼠血清ALT、AST、ALB水平;用放射免疫法检测各组大鼠血清LN水平;摘取大鼠肝脏，将肝左叶置于4％多聚甲醛溶液中固定，用石蜡将其包埋，HE染色及Masson染色后，光镜下观察各组大鼠肝组织的病理形态学改变。将肝右叶置于液氮中速冻，保存于-80℃冰箱内，用免疫组化法观察各组大鼠肝组织IGFBP7、Col-Ⅳ蛋白表达，反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerasechain reaction RT-PCR)法检测各组大鼠肝组织中IGFBP7 mRNA、Col-ⅣmRNA的表达。
　　结果:
　　1.各组大鼠的一般情况A组大鼠一般情况良好，反应机敏，毛发旺盛，有光泽，体重持续增长。其余各组大鼠一般情况较差，皮毛暗淡、松弛，反应迟钝，形体消瘦，脾气急躁，易激惹，且在实验过程中均有死亡情况:B组死亡2只大鼠，C、D、E、F组各死亡1只大鼠。
　　2.各组大鼠肝组织的病理形态学改变光镜下，A组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞多为单核，呈条索样，围绕中央静脉放射状排列。B组大鼠肝小叶结构已破坏，肝细胞明显肿胀、广泛坏死，肝脏汇管区扩大、结缔组织明显增生并伴有大量炎性细胞浸润，形成假小叶。C、D、E、F各组大鼠肝小叶结构较为完整、清晰，肝细胞损伤程度明显减轻，肝脏汇管区的纤维结缔组织增生不明显，形成的假小叶明显减少。D、E、F各组大鼠肝组织病理改变依次减轻，C组大鼠肝脏病理形态变化介于B组与D组之间。表明中药鳖甲煎丸对减轻大鼠肝纤维化的疗效确切，且优于西药秋水仙碱。
　　3.各组大鼠血清学指标ALT、AST和ALB的水平变化各组大鼠血清ALT、AST含量:与A组大鼠相比，B、C、D、E、F各组大鼠血清ALT和AST的含量明显升高(P＜0.05);与B组大鼠相比，C、D、E、F各组大鼠血清ALT、AST的含量明显减低(P＜0.05);与C组太鼠相比，D组大鼠血清ALT、AST的含量较之升高（P＜0.05），F组大鼠血清ALT、AST的含量较之明显降低(P＜0.05)，E组大鼠血清ALT、AST的含量与之比较，差异无统计学意义(P＞0.05);D、E、F各组大鼠相比，血清ALT、AST的含量差异显著，有统计学意义(P＜0.05)，其中D组大鼠含量最高，F组大鼠含量最低，E组大鼠含量居中。
　　各组大鼠血清ALB含量显示:与A组大鼠相比，B、C、D、E、F各组大鼠血清ALB的含量明显降低（P＜0.05）;与B组大鼠相比，C、E、F各组大鼠血清ALB的含量明显升高（P＜0.05），而D组大鼠与其差别无统计学意义（P＞0.05）;与C组大鼠相比，F组大鼠血清ALB的含量较之明显升高(P＜0.05)，D组大鼠血清ALB水平减低(P＜0.05)，E组大鼠与之相比，差别无统计学意义(P＞0.05);D、E、F各组大鼠血清ALB含量相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中F组大鼠含量最高，E组大鼠次之，D组大鼠含量最低。
　　4.各组大鼠血清LN含量的比较各组大鼠血清LN含量结果示:与A组大鼠相比，B、C、D、E、F各组大鼠血清LN含量明显升高(P＜0.05);与B组大鼠相比，C、D、E、F各组大鼠血清LN含量明显降低(P＜0.05);与C组大鼠相比，D组大鼠血清LN含量较之升高(P＜0.05)，F组大鼠血清LN含量较之明显减低(P＜0.05)，E组大鼠血清LN含量与之比较，差异无统计学意义(P＞0.05);D、E、F各组大鼠之间血清LN含量相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中F组大鼠含量最低，D组大鼠含量最高，E组大鼠含量居中。
　　5.各组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA、Col-Ⅳ mRNA的表达各组大鼠肝脏组织IGFBP7 mRNA的表达:与A组大鼠相比，B、C、D、E、F各组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达均增强(P＜0.05);与B组大鼠相比，C、D、E、F各组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达均减弱(P＜0.05);与C组大鼠相比，F组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达较之减弱(P＜0.05)，D组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达较之增强(P＜0.05)，E组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达与之相比，差异无统计学意义(P＞0.05);D、E、F各组间大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，F组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达最弱,D组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达最强，E组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA表达居中。
　　各组大鼠肝脏组织Col-ⅣmRNA的表达:与A组大鼠相比，B、C、D、E、F各组大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达均增强(P＜0.05);与B组大鼠相比，C、D、E、F各组大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达均减弱(P＜0.05);与C组大鼠相比，F组大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达较之减弱(P＜0.05)，D组大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达较之增强（P＜0.05），E组大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达与之相比，差异无统计学意义（P＞0.05）;D、E、F各组间大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)，其中，F组大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达最弱，D组大鼠肝组织Col-ⅣmRNA表达最强，E组大鼠肝组织Col-Ⅳ mRNA表达居中。
　　6.各组大鼠的肝组织中IGFBP7、Col-Ⅳ蛋白表达IGFBP7蛋白表达:A组大鼠肝组织内IGFBP7蛋白呈棕黄色或棕褐色弱阳性表达，与A组大鼠比较，B、C、D、E、F各组大鼠IGFBP7蛋白阳性表达程度均增强(P＜0.05);与B组大鼠相比，C、D、E、F各组大鼠IGFBP7蛋白阳性表达程度均减弱（P＜0.05）;与C组大鼠相比，F组大鼠IGFBP7蛋白阳性表达程度较之明显减弱(P＜0.05)，D组大鼠IGFBP7蛋白阳性表达程度较之增强(P＜0.05)，E组大鼠与之差异无统计学意义(P＞0.05);D、E、F各组大鼠之间IGFBP7蛋白阳性表达程度相比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）:F组大鼠IGFBP7蛋白阳性表达程度最弱，D组大鼠IGFBP7蛋白阳性表达程度最强，E组大鼠IGFBP7蛋白阳性表达程度居中。
　　Col-Ⅳ蛋白表达:A组大鼠肝组织内Col-Ⅳ蛋白呈棕黄色或棕褐色弱阳性表达，与A组大鼠比较，B、C、D、E、F各组大鼠Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度均增强(P＜0.05);与B组大鼠相比，C、D、E、F各组大鼠Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度均减弱(P＜0.05);与C组大鼠相比，F组大鼠Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度较之明显减弱(P＜0.05)，D组大鼠Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度较之增强(P＜0.05)，E组大鼠与之差异无统计学意义(P＞0.05);D、E、F各组大鼠之间Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度相比较，差异均有统计学意义(P＜0.05):F组大鼠Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度最弱，D组大鼠Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度最强，E组大鼠Col-Ⅳ蛋白阳性表达程度居中。
　　结论:
　　1.中药鳖甲煎丸可以明显改善肝纤维化太鼠肝功能,减轻其肝纤维化的程度。
　　2.中药鳖甲煎丸可以明显降低肝纤维化大鼠血清LN水平，使其在肝窦周间隙的沉积减少，从而进一步降低ECM在肝组织的蓄积，此可能为其抗肝纤维化的机制之一。
　　3.中药鳖甲煎丸可以明显降低大鼠肝组织中的IGFBP7 mRNA和Col-Ⅳ mRNA水平及IGFBP7和Col-Ⅳ的蛋白表达，提示其可以抑制肝星状细胞的增殖与活化，减少ECM的合成并促进其降解，此可能为其抗肝纤维化的机制之一。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 实验大鼠的一般情况

2 各组大鼠肝组织的病理形态学改变

3 各组大鼠血清学指标ALT、AST和ALB的水平变化

4 各组大鼠血清LN含量的比较

5 各组大鼠肝组织IGFBP7 mRNA、Col-Ⅳ mRNA的表达

6 各组大鼠的肝组织中IGFBP7、Col-Ⅳ蛋白表达

附图

附表

讨论

1 肝纤维化的相关研究

2 研究目的

3 动物模型的制备

4 鳖甲煎丸的选用

5 实验指标的观察和分析

结论

参考文献

综述 胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)和肝纤维化

致谢

个人简历