双心室绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心功能影响的研究

摘要

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多种心血管疾病的终末状态，其病因多种多样，发病率高，预后不良，是心内科治疗学上的难题。导致心力衰竭发生发展的基本机制是心脏重塑，心脏重塑是心脏结构和功能在受刺激下发生的适应性反应，这些适应性变化在早期对于维持正常心功能发挥作用，但随着心衰进程的加重，这些变化导致泵衰竭的进展和/恶性心律失常的发生。
　　心脏重塑包括结构重塑和心电重塑。结构重塑表现为心肌重量、心室容量的增加和心室形状的改变（横径增加呈球状），心肌收缩力的下降。随着心脏结构的改变，发生心脏电活动的改变，左室电活动的重构继发于心脏结构的改变。心电重构包括多种离子通道、兴奋收缩耦联（例如肌浆网钙循环的变化）和细胞间缝隙连接的变化。这些变化导致心脏电稳定性降低，心脏自律性升高，心室肌细胞静息电位和动作电位幅度减小，传导减慢，动作电位时程延长;同时存在发生心律失常的血流动力学基础，容易发生以室性心动过速和心室颤动为代表的恶性心律失常。具体体现为心肌兴奋性增高、传导延迟、复极不均一，心室肌电异步性明显增大，更易形成折返。
　　慢性充血性心力衰竭动物模型制作方法主要有心肌缺血型、压力负荷型、容量负荷型和心肌病变型等。本研究通过升主动脉环扎法建立压力负荷型慢性充血性心力衰竭动物模型，并观察心衰后心脏机械和电生理功能的变化。探索建立慢性心力衰竭动物模型的方法，为研究心力衰竭发展过程中的血流动力学改变、神经内分泌系统、心肌细胞和亚细胞水平的改变提供了重要资料。
　　近年来，CHF的治疗取得了巨大的进展，但随着病情的进展，许多重症CHF患者仍有明显症状，药物治疗反应不佳。人们在倡导药物治疗的同时，也在积极寻求各种非药物治疗方法，其中心脏移植无疑是治疗CHF的最有效方法，但由于供体有限及术后抗排斥的高额医疗费用使其应用受限。心肌干细胞移植尚处于基础研究阶段，心脏再同步起搏技术治疗CHF可改善患者的血流动力学和临床症状，但适应范围有限。
　　传统的正性肌力药物地高辛治疗，减少因心衰导致的死亡或再住院率。但没有降低心衰患者的全因死亡率，并且还导致轻微猝死发生率的增高。其他依赖细胞内环磷酸腺苷增加的正性肌力药物如氨力农、米力农等因增加慢性心力衰竭患者死亡率已被抛弃。这些药物显示在急性期改善心功能的同时伴有心律失常发生增加的风险，特别是在重度左室功能下降、急性缺血或体内儿茶酚胺升高的情况下更容易发生。
　　心脏收缩调节（cardiac contractility modulation，CCM）作为一种新的机械装置治疗方法进入人们视线，它是在绝对不应期内给予的非兴奋性刺激(Non-Excitatory Currents，NEC)即绝对不应期电刺激，它不会诱发心肌细胞产生动作电位，但这个刺激可以使心肌细胞的这一次收缩能力得到加强。
　　肌浆网钙ATP酶(SERCA2)又被称为肌浆网钙泵，参与细胞内钙离子调节的主要蛋白，能促进心肌的收缩和舒张。在每一个心动周期，钙离子通过钙释放通道-雷尼丁受体从肌浆网释放到细胞浆，触发心肌的收缩。在舒张期，SERCA2逆浓度梯度摄取肌浆内钙离子返回到肌浆网储存池，以备下次钙离子的释放。SERCA2分为SERCA2a、SERCA2b和SERCA2c三种亚型。其中SERCA2a主要在心脏和骨骼肌慢肌纤维中表达，心脏中主要是SERCA2a，而SERCA2b存在比较广泛，在各种组织中都有表达，可部分代替SERCA2a的功能。在慢性心衰情况下，心肌细胞功能失调的特征变化之一就是SERCA2a的活性及其mRNA表达下降，而增加SERCA2a的表达后可促进下降的心肌收缩力得到恢复，心功能得到改善，这点在动物实验和临床研究中都得到证实。
　　miRNAs是一组新发现的小的非蛋白编码的核糖核酸，包含有大约19-25个核苷酸序列，通过调控转录后翻译对基因表达发挥重要的调控作用，被认为是现代医学最令人激动的发现之一。大量证据表明:miRNAs在心衰发病机理方面发挥重要作用。miRNAs133在心脏中有较高表达，与心脏肥大有着密切的关系，有抑制心肌细胞肥大的作用，同时具有抗心肌细胞凋亡，参与调控心肌重构发挥重要的作用。已有研究证明主动脉缩窄建立的心衰动物模型中，miRNAs133的表达水平明显下降。另有研究显示miRNAs可以绑定到SERCA2a3'端非编码区，发挥转录后调控SERCA2a的表达。
　　既往实验和临床研究绝对不应期刺激多采用单心室刺激的方法，双心室刺激是否较单心室刺激在改善心功能方面更为有效和安全，本实验对此进行探讨。双心室绝对不应期刺激改善心力衰竭心肌的收缩功能和电重构，其具体的作用机制目前尚不清楚，本研究通过荧光定量聚合酶链反应的方法，分析CCM对兔心衰心室肌SERCA2和miRNAs133基因表达水平的影响，探讨其在分子水平的作用机制。
　　第一部分、兔慢性充血性心力衰竭时心脏机械和电生理的变化
　　目的:通过升主动脉环扎法建立慢性充血性心力衰竭动物模型，观察心衰后心脏机械和电生理功能的变化。
　　方法:40只新西兰大白兔随机分为2组:心衰组(n=30)于升主动脉根部远端1.0cm处行环扎缩窄术;假手术组(n=10)不给予主动脉环扎，其余步骤同心衰组。术中及术后12周行血清BNP、超声心动图和心脏电生理检查。
　　结果:
　　1.一般情况:40只新西兰大白兔，心衰组30只术中死亡5只，12周后心衰程度没满足入选标准2只，造模成功23只;假手术组10只术中无死亡，12周后均存活。术前心衰组和假手术组体重(Weight)、呼吸频率(R)和心率(HR)无明显差别(P＞0.05);12周后心衰组兔表现为精神不振，口唇紫绀，呼吸、心率较假手术组增加(P＜0.05);体重较假手术组减少(P＜0.05)。
　　2.慢性心衰兔电生理各项指标变化:术中电生理检查假手术组和心衰组各项指标无明显差别（P＞0.05）;术后12周，心衰组舒张期阈值、有效不应期、室颤阈值较假手术组明显降低(P＜0.05);而QT间期离散度心衰组较假手术组相比有增加趋势，但统计学分析无明显差别(P＞0.05)。
　　3.慢性心衰兔超声心动图各项指标变化:术前假手术组和心衰组超声心功能各项指标无明显差别（P＞0.05）;术后12周，心衰组舒张末期室间隔厚度、左室后壁厚度、左室收缩末内径和左室舒张末内径较假手术组明显升高(P＜0.05);而左室射血分数、左室短轴缩短率和E/A比值心衰组较假手术组明显下降(P＜0.05);反映心室机械收缩不同步指标的sPwMD和IVMD，术后12周心衰组明显高于假手术组(P＜0.05)。
　　4.慢性心衰兔血清BNP表达水平的变化:术前两组间BNP表达水平比较无统计学差异(P＞0.05)。12周时心衰组血清BNP表达水平较假手术组组显著升高（P＜0.05）。
　　结论:升主动脉环扎缩窄法可有效建立慢性心衰动物模型，心衰后心脏机械和电生理发生相应的变化。
　　第二部分、双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心功能的作用
　　目的:观察双心室绝对不应期电刺激对慢性心力衰竭兔心脏功能和心室结构重塑的影响，探讨绝对不应期电刺激治疗慢性心力衰竭的最佳模式和安全性。
　　方法:23只通过升主动脉根部套扎法建立慢性心力衰竭模型的新西兰大白兔，将其分为对照组、左室刺激组和双心室刺激组。左室刺激组和双室刺激组发放CCM信号，每天刺激6小时，连续刺激7天，于电刺激前后观察心室结构、心脏功能方面的变化。
　　结果:
　　1.CCM刺激前三组兔超声心功能各项指标(LVEDD、LVESD、EF、FS、IVS、LVPW、E/A)无明显差别(P＞0.05);CCM刺激后，与对照组相比，左室刺激组和双心室刺激组LVESD，LVEDD明显下降，以双心室刺激组下降更加明显（P＜0.05）;而LVEF，LVFS，双心室刺激组和左室刺激组较对照组升高，以双心室刺激组升高更加明显(P＜0.05); IVS、IVPW、E峰、A峰和E/A比值各组比较无明显变化（P＞0.05）。
　　2.CCM刺激对血浆BNP水平的影响:CCM刺激前血浆BNP水平三组相比无明显差别(P＞0.05);CCM刺激后血浆BNP水平三组相比:双心室刺激组降低最明显、其次为左室刺激组(P＜0.05)，对照组较前相比水平没有明显变化分别(P＞0.05)。
　　相关分析显示:血清BNP水平与LVESD、LVEDD呈正相关;与LVEF和LVFS呈负相关。
　　3.CCM刺激对心室重塑的影响:术后对三组心衰兔心脏重量和心脏重量指数比较:左室刺激组和双心室刺激组心脏重量和心脏重量指数较对照组下降，以双心室组下降更加明显（P＜0.05）。
　　结论:双心室绝对不应期电刺激可增加慢性心力衰竭心肌的收缩力，改善心功能，逆转心室重塑，较单心室刺激有更大优势。
　　第三部分、双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心脏电生理的作用
　　目的:探讨双心室绝对不应期刺激对心衰心电重构有着何种影响，这种影响是继发于心脏功能改善的基础上还是独立于心室结构重塑，是否会产生新的心律失常危险。
　　方法:23只通过升主动脉根部套扎法建立慢性心力衰竭模型的新西兰大白兔，将其分为对照组、左室刺激组和双心室刺激组。左室刺激组和双室刺激组发放CCM信号，每天刺激6小时，连续刺激7天，于电刺激前后观察电生理指标并心律失常变化。
　　结果:
　　1.CCM刺激后三组兔舒张期阈值的变化:与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后舒张期阈值有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.三组兔心肌组织在CCM刺激后有效不应期的变化:与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后有效不应期有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义（P＜0.05）。
　　3.CCM刺激后三组兔室颤阈值的变化:与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后室颤阈值有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.CCM刺激后三组兔QT间期离散度的变化:与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后QT间期离散度有下降，但统计学分析无明显差别(P＞0.05)。
　　5.CCM刺激对心律失常的影响:动态心电图监测显示，左室刺激组和双心室刺激组发放CCM信号时与信号关闭时相比未见有心率的变化，且同对照组组相比CCM刺激组未见有室性心律失常的增加。
　　结论:双心室绝对不应期电刺激可提高舒张期阈值、室颤阈值和延长有效不应期，增加心电稳定性，逆转心衰结构重塑和电重塑，且不增加室性心律失常的发生，较单心室刺激有更大优势。
　　第四部分、双心室绝对不应期刺激对心衰兔心室肌SERCA2和miRNAs133的影响
　　目的:通过荧光定量聚合酶链反应的方法，分析CCM对兔心衰心室肌SERCA2和miRNAs133基因表达水平的影响，探讨其在分子水平的作用机制。
　　方法:术后留取左室心肌标本，通过荧光定量聚合酶链反应的方法检测心肌组织SERCA2和miRNAs133的表达水平。
　　结果:
　　1.以GAPDH为内参照基因，得到目的基因表达的相对定量值(RQ值)，将RQ值用于统计分析。分析显示:对照组SERCA2a mRNA的RQ值为1.66±0.42;单心室刺激组和双心室刺激组SERCA2a mRNA的RQ值分别为3.16±0.74和4.51±0.56;与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后SERCA2a mRNA表达有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.对照组miRNAs133的RQ值为11.91±2.37;单心室刺激组和双心室刺激组miRNAs133的RQ值分别为31.33±5.16和38.90±6.42;与对照组相比，双心室刺激组和单心室刺激组在给予CCM刺激后miRNAs133表达有升高的趋势，其中以双心室刺激组升高更加明显，有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:CCM刺激后心衰兔心肌SERCA2a mRNA和miRNAs133表达水平提高，二者水平呈正相关。CCM刺激可能通过引起心肌局部miRNAs133表达上调，进而调控SERCA2表达水平促进心脏功能改变。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 兔慢性充血性心力衰竭时心脏机械和电生理的变化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心功能的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 双心室绝对不应期刺激对心力衰竭兔心脏电生理的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 双心室绝对不应期刺激对心衰兔心室肌SERCA2和miRNAs133的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 心力衰竭动物模型进展

综述二 心力衰竭的非药物治疗进展

致谢

个人简历