大黄酚脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及机制研究

摘要

脑血管病是临床多发病、常见病之一，具有高发病率、高复发率、高致残率、高致死率的特点，并有年轻化趋势，影响患者的生活和工作，给社会和家庭带来沉重的医疗负担。在缺血性脑血管病的康复治疗中，恢复缺血区的血流供应是避免脑组织缺血损伤的首要条件，但与此同时带来的再灌注损伤也是目前医学研究热点。在脑缺血再灌注损伤发生发展过程中，有众多病理机制参与其中，如兴奋性氨基酸的过度释放、体内离子水平失衡、能量耗竭、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡，这些因素相互作用最终导致脑组织的不可逆损害。因此，近年来化学药物如钙离子拮抗剂，自由基清除剂，以及神经保护剂等化学药物用于治疗脑缺血再灌注损伤。但是，用药后出现的一系列不良反应如抗药性、胃肠道反应，脑出血等超出了临床长期治疗所带来的治疗效果。近年来，临床应用和实验报道中药成分在治疗脑缺血再灌注损伤方面具有很大的优势。
　　大黄Radixet rhizoma Rhei为蓼科植物药用大黄Rheum officinale Baill、掌叶大黄heum palmatum L、或唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim的干燥根及根茎，主产于四川、青海、甘肃等地。大黄始载于《神农本草经》，苦寒，入脾、胃、大肠、心包、肝经，主攻积滞，可清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒之功能。现代药理研究表明，大黄除具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经的作用外，尚具有清除自由基、降血脂、抗动脉硬化、抗癌、延缓衰老等药理作用。大黄的主要药效成分是蒽醌类化合物，大黄酚(Chrysophanol，Chry)属羟基蒽醌类，具有抗病毒、抗癌、抗炎、抗菌、降压和解痉等作用。
　　本课题组前期实验证明大黄酚在体外可清除超氧自由基、DPPH自由基、羟基自由基，对离体大鼠肝、脑丙二醛(Malondiadehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)生成有明显的抑制作用;在小鼠脑缺血再灌注损伤后，大黄酚改善学习记忆功能并提高耐缺氧的能力，改善脑组织病理形态学损伤，结果表明大黄酚具有脑保护作用，但大黄酚对脑的保护作用机制尚不明确。
　　大黄酚属于脂溶性化合物，在水中溶解度极小，见光易分解，性质极其不稳定，且对胃肠有刺激作用，且生物利用度不高，影响了药物的临床应用。因此，本研究首先从中药大黄中提取大黄酚粗品，再采用制备高效液相色谱法（PHPLC）进行单体分离，再完成大黄酚脂质体(Chrysophanolliposomes，Chr-lip)的制备，建立昆明种小鼠脑缺血再灌注模型，动态观察小鼠脑缺血再灌注后神经功能损伤评分，神经元超微结构，病理组织学改变以及SOD，谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)，一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)的活性，MDA，一氧化碳(Nitricoxide，NO)含量，以及Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3等表达变化。确定缺血后与氧化损伤及凋亡的关系，并选用大黄酚脂质体进行干预，评价干预后神经功能缺损评分，以及大黄酚脂质体对氧化应激，自由基损伤，细胞凋亡信号通路韵作用，初步探讨其在缺血再灌注损伤后的脑保护作用机制。本研究分三部分，现将各部分内容概述如下。
　　第一部分大黄酚的提取纯化及大黄酚脂质体制各
　　目的:建立从大黄中分离纯化大黄酚的PHPLC方法，考察大黄酚脂质体的处方和制备工艺进行研究，并评价其质量。
　　方法:建立HPLC测定大黄酚的分析方法，采用Hypersil BDS C8(4.6×150 mm，5μm)，流动相为0.1％磷酸-甲醇溶液(15∶85)，流速为1.0mL·min-1，柱温35℃，检测波长254 nm;其次，建立从大黄提取液中分离纯化大黄酚的PHPLC法，采用ZORBAXSB-C18:(21.2 mm×250 mm，7μm)，流动相:0.1％磷酸∶甲醇(15∶85)，柱温:35℃，流速:20 mL·min-1，检测波长:254 nm，进样量:7mL，馏分收集:基于峰，阈值Min:2.2。制备所得大黄酚单体采用核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)进行结构鉴定，HPLC法检测其纯度;再次，对大黄酚脂质体的处方和制备工艺进行研究，采用薄膜-超声法制备大黄酚脂质体，并考察大黄酚脂质体的包封率、形态学、粒径分布、稳定性。
　　结果:
　　所得大黄酚单体经NMR结构鉴定为大黄酚，经HPLC法检测，其含量为98.9％。大黄酚脂质体包封率为88.5％。粒径较为均匀，相互之间无聚集现象，粒径均小于2μm，稳定性好。
　　小结:
　　建立PHPLC分离纯化大黄中大黄酚方法，该方法灵敏度高，操作简便，所得大黄酚单体含量为98.9％。大黄酚脂质体包封率为88.5％，可用于药理学研究。
　　第二部分大黄酚脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤所致氧化应激的影响
　　目的:动态观察小鼠脑缺血再灌注后神经功能损伤评分，神经元超微结构，病理组织学改变以及SOD，GSH-PX，NOS的活性，MDA，NO含量。研究大黄酚脂质体对脑缺血再灌注损伤所致氧化应激的作用，探讨大黄酚脂质体抗氧化作用的相关机制。
　　方法:应用线栓法建立小鼠脑缺血再灌注模型，采用健康雄性昆明种小鼠，体质量24～26 g。实验1:小鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血再灌注组（脑缺血1h后再灌注，按再灌注不同时间点分为3h、6h、12h、24 h、48 h、72h6个亚组。实验2:小鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血再灌注24 h组、大黄酚脂质体(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)三个剂量组。大黄酚脂质体组于脑缺血再灌注前3天连续腹腔给予大黄酚脂质体，每天一次。于规定时间检测小鼠神经功能损伤评分;采用HE法，透射电镜法观察小鼠脑组织病理组织学，神经元超微结构改变;采用试剂盒法检测SOD，GSH-PX，NOS的活性和MDA，NO含量。
　　结果:
　　1、大黄酚脂质体减轻神经功能损伤正常对照组和假手术组，未见明显神经功能损害。脑缺血再灌注组神经功能评分显著高于假手术组（P＜0.01）;以24 h神经功能评分最高。结果表明，脑缺血再灌注后可损伤小鼠神经功能。与脑缺血再灌注24 h组比，大黄酚脂质体(10.0，5.0，0.5mg·kg-1)组神经功能缺陷评分均显著降低(P＜0.05～P＜0.01)，以大黄酚脂质体(10.0 mg·kg-1)组效果最为显著。结果表明，大黄酚脂质体减轻神经功能损伤。
　　2、大黄酚脂质体改善神经元超微结构正常对照组和假手术组神经元结构正常，可见丰富的细胞器。脑缺血再灌注3h可见神经元染色质密度增高，核膜皱缩、边集,线粒体轻微肿胀，可见空泡。脑缺血再灌注6h神经元染色质密度增高，核膜严重皱缩、边集，线粒体部分溶解，内质网部分溶解，细胞器数目减少，细胞质高度水肿，可见空泡。脑缺血再灌注12h可见核固缩，细胞核水肿，染色质边集，胞浆内有大量的空泡形成，有线粒体完全溶解;脑缺血再灌注24 h可见细胞器明显减少，线粒体结构空泡状，外膜隐约可见，可见凋亡小体，粗面内质网脱颗粒;脑缺血再灌注48 h神经元核固缩，核膜内陷，核染色质成团块状边集于核膜下，细胞质高度水肿，细胞器数目少，线粒体不同程度脱空，可见溶酶体。脑缺血再灌注72 h组可见神经元核固缩，核膜溶解，核染色质成团块状边集于核膜下，线粒体不同程度断裂，粗面内质网脱颗粒，细胞器少。结果表明，脑缺血再灌注损伤小鼠神经元超微结构。大黄酚脂质体(10.0，5.0 mg·kg-1)组神经元染色体比较均匀，核膜清楚，线粒体数目有所减少，粗面内质网有轻度肿胀，核糖体数目有一定的减少;大黄酚脂质体(0.5 mg·kg-1)组对神经元超微结构也有改善作用。结果表明，大黄酚脂质体改善神经元超微结构。
　　3、大黄酚脂质体改善病理组织学损害正常对照组和假手术组未见明显病理损害改变。脑缺血再灌注组3h脑缺血半球组织细胞轻度水肿，大小不等的空泡在细胞间隙出现，神经元及胶质细胞固缩，无明显细胞坏死;脑缺血再灌注6h-12 h之间时，胞质明显水肿等上述症状逐渐加重;脑缺血再灌注24 h-48 h时神经元核固缩、浓染，染色质浓缩集聚于核周围，呈凋亡前或凋亡改变，神经元结构明显破裂;脑缺血再灌注72 h时神经元水肿逐渐减轻，部分神经元周围出现水肿。结果表明，脑缺血再灌注可致小鼠脑病理组织学改变。大黄酚脂质体治疗组明显改善脑缺血再灌注损伤后的病理组织学损伤。
　　4、大黄酚脂质体可增强抗氧化能力脑缺血再灌注3 hMDA含量升高，12h后MDA含量达到最大，并持续到24 h，48 h-72 h后有所下降，与假手术组比，脑缺血再灌注各时间点MDA含量增加有显著性差异（P＜0.01）。脑缺血再灌注3 h SOD活性明显降低，并与12h后SOD活性达到最低，24 h-72 h后有所增加，与假手术组比，脑缺血再灌注各时间点SOD活性降低有显著性差异（P＜0.01）。脑缺血再灌注3 h GSH-PX活性明显降低，并与24 h后GSH-PX活性达到最低，48 h-72 h后有所增加;与假手术组比，脑缺血再灌注各时间点GSH-PX活性降低有显著性差异（P＜0.01）。脑缺血再灌注3 hNO含量升高，并与6h后NO含量达到最大，并持续到24h，48 h-72 h后有所下降;与假手术组比，脑缺血再灌注各时间点NO含量增加有显著性差异（P＜0.01）。脑缺血再灌注3 h NOS活性明显增加，并与12h后NOS活性达到最高，并持续到24 h，48 h-72 h后有所减少;与假手术组比，脑缺血再灌注组NOS活性增加有显著性差异（P＜0.01）。结果表明，脑缺血再灌注后，小鼠体内抗氧化能力减弱。与脑缺血再灌注24 h组比，大黄酚脂质体(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)组显著降低MDA含量(P＜0.05～P＜0.01)，NO含量(P＜0.05～P＜0.01)，NOS活性(P＜0.01，P＜0.05，P＞0.05)，显著增强SOD活性（P＜0.01），GSH-PX活性(P＜0.05～P＜0.01)。以大黄酚脂质体(10.0 mg·kg-1)组效果最为显著。结果显示，大黄酚脂质体可增强抗氧化能力。
　　小结:
　　脑缺血再灌注后，神经功能评分，病理组织学损伤，神经元超微结构损伤，GSH-PX，SOD，NOS的活性，MDA，NO含量呈动态改变，并且脑缺血再灌注12 h～24 h是脑缺血再灌注损伤过程的重要时间转折点。大黄酚脂质体能改善小鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能评分，病理组织学损伤，神经元超微结构损伤，提高脑组织中SOD，GSH-PX活性，抑制NOS的活性，降低脑组织中MDA，NO的含量。因此，我们推测大黄酚脂质体可能通过抗氧化应激实现其对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。
　　第三部分大黄酚脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤所致细胞凋亡的影响
　　目的:动态观察小鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3等动态表达变化。研究大黄酚脂质体对脑缺血再灌注损伤小鼠的抗凋亡作用，探讨大黄酚脂质体抗凋亡作用的相关机制。
　　方法:应用线栓法建立小鼠脑缺血再灌注模型，采用健康雄性昆明种小鼠，体质量24～26 g。实验1:小鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血再灌注组（脑缺血1h后再灌注，按再灌注不同时间点分为3h、6h、12h、24 h、48 h、72h6个亚组。实验2:小鼠随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血再灌注24 h组、大黄酚脂质体(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)三个剂量组。大黄酚脂质体组于脑缺血再灌注前3天连续腹腔给予大黄酚脂质体，每天一次。于规定时间采用Hoechst33258染色检测神经元凋亡;免疫组织化学法、western blot法、实时荧光定量PCR法分别检测Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3阳性细胞数、蛋白、mRNA水平表达。
　　结果:
　　1、大黄酚脂质体减少神经元凋亡数目结果显示，正常对照组和假手术组小鼠脑组织偶见神经元凋亡，脑缺血再灌注3h可有少量的染色体深染、核浓缩的凋亡细胞;随着再灌注时间的延长，神经元细胞核缩小，染色质断裂凝集显著增多，荧光强度逐渐增加。而在48 h后核深染、核浓缩，凋亡神经元数目有所减少。与假手术组比，脑缺血再灌注各组神经元凋亡数目有显著性差异（P＜0.05）。结果表明，脑缺血再灌注可致小鼠脑神经元凋亡。大黄酚脂质体(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)组小鼠脑组织部分神经元染色体深染、核浓缩，神经元凋亡数目较脑缺血再灌注24 h组均显著减少(P＜0.05～P＜0.01)，以大黄酚脂质体(10.0 mg·kg-1)组效果最为显著。结果显示，大黄酚脂质体可显著减少神经元凋亡数目。
　　2、大黄酚脂质体对细胞凋亡相关阳性细胞数变化的影响脑缺血再灌注组时Bax，Cytc，caspase3阳性细胞呈逐渐增多的趋势，于24 h时达最高峰，再灌注48 h、72 h时有所下降。与假手术组比，脑缺血再灌注组Bax，Cytc，caspase3阳性细胞数目明显增多，具有显著性差异（P＜0.01）。脑缺血再灌注组Bcl-2阳性细胞呈逐渐减少的趋势，24 h时达低谷，再灌注48 h-72h时有所上升。与假手术组比，脑缺血再灌注各组Bcl-2阳性细胞数目减少具有显著性差异(P＜0.01)。结果表明，脑缺血再灌注后Bax，Cytc，caspase3阳性细胞数增加，Bcl-2阳性细胞数降低。与脑缺血再灌注24 h组比，大黄酚脂质体(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)组中Bax、Cytc、caspase3阳性细胞数均减少(P＜0.05～P＜0.01)，Bcl-2阳性细胞数提高(P＜0.05～P＜0.01);以大黄酚脂质体(10.0 mg·kg-1)组效果最为显著。
　　3、大黄酚脂质体细胞凋亡相关蛋白表达变化的影响脑缺血再灌注组时Bax，Cytc，caspase3蛋白表达呈逐渐增多的趋势，于24 h时达最高峰，再灌注48 h、72 h时有所下降。与假手术组比，脑缺血再灌注组Bax，Cytc，caspase3蛋白明显上调(P＜0.01);脑缺血再灌注组Bcl-2蛋白表达呈逐渐减少的趋势，24 h时达低谷，再灌注48 h-72 h时有所上升，与假手术组比，Bcl-2蛋白表达下调(P＜0.05～P＜0.01)。结果表明，脑缺血再灌注增加Bax，Cytc，caspase3蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达。与脑缺血再灌注24 h组比，大黄酚脂质体(10.0，5.0 mg·kg-1)组Bax，Cytc，caspase3蛋白表达均减少(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表达均提高（P＜0.01）;大黄酚脂质体(0.5 mg·kg-1)组Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3蛋白表达水平也有显著性差异(P＜0.05～P＜0.01)
　　4、大黄酚脂质体对细胞凋亡相关mRNA表达变化结果显示，与假手术组比，脑缺血再灌注各组Bax，Cytc，caspase3 mRNA水平明显上调(P＜0.05～P＜0.01)，于脑缺血再灌注24 h时达到高峰;Bcl-2 mRNA水平明显下调（P＜0.01），于脑缺血再灌注24 h时达到低谷。结果表明，脑缺血再灌注后可上调Bax，Cytc，caspase3mRNA表达，下调Bcl-2 mRNA表达。与脑缺血再灌注24 h组比，大黄酚脂质体(10.0，5.0，0.5 mg·kg-1)组下调Bax，Cytc，caspase3 mRNA水平(P＜0.05～P＜0.01)，上调Bcl-2 mRNA水平(P＜0.01)。
　　小结:
　　脑缺血再灌注后神经元凋亡数目，Bax，Bcl-2，Cytc，caspase3表达呈动态改变，且脑缺血再灌注24 h是脑缺血再灌注损伤过程的重要时间转折点。大黄酚脂质体降低神经元凋亡数目，下调Bax，Cytc，caspase3，上调Bcl-2表达。因此，我们推测大黄酚脂质体可能通过抗凋亡实现其对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 大黄酚的提取纯化及大黄酚脂质体制备

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 大黄酚脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤所致氧化应激的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 大黄酚脂质体对小鼠脑缺血再灌注损伤所致细胞凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 大黄酚神经保护作用的研究进展及机制探讨

致谢

个人简历