非T细胞结合肽对胶原诱导关节炎大鼠的治疗作用及其机制研究

摘要

类风湿关节炎(RA）是一种常见的自身免疫性疾病。目前其病因仍不清楚，但深入研究表明T细胞在类风湿关节炎的发病过程中发挥重要作用。胶原诱导性关节炎模型由于其引起的免疫机制和关节病理与类风湿关节炎相似，被广泛地应用于RA机制研究及关节炎治疗药物的筛选。
　　变构肽在自身免疫疾病中的免疫调节作用研究已有一定基础。Ⅱ型胶原(CⅡ)是涉及RA发病机制的重要的自身抗原。非T细胞结合肽(Non-T cellbinding peptide，NTAP)是一种CⅡ263-272特定表位的变构肽，采用甘氨酸或丙氨酸替换了类风湿关节炎主要抗原的疾病相关肽段CⅡ263-272抗原肽上能够与TCR结合的氨基酸，保留CⅡ263-272抗原肽上能与RA相关的MHCⅡ类分子结合的氨基酸。本研究采用胶原诱导性关节炎大鼠模型，观察TAP对关节炎的治疗作用，并且从辅助性T细胞亚群和相关细胞因子，以及凋亡等方面来探讨NTAP的作用机制。
　　第一部分、非T细胞结合肽对胶原诱导关节炎大鼠的治疗作用
　　目的:观察NTAP对胶原诱导关节炎大鼠的治疗作用。
　　方法:选择6-7周龄的Lewis雌性大鼠，随机分为对照组和CIA模型组。CIA模型组大鼠于尾根部皮内注射牛Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂配制的乳剂，7天后同法加强免疫1次。成模大鼠随机分为模型组、NTAP组、原型肽组和无关肽组，模型组、NTAP组每组10只，原型肽组、无关肽组每组8只。尾静脉注射给药，给药剂量分别为1mg/kg，1.07 mg/kg和1 mg/kg，隔天一次，连续两周。模型组和对照组以相同方法和体积注射PBS。给药期间进行关节炎症评分，给药结束后144h处死大鼠，X光检查大鼠后爪的跖骨变化，HE染色法观察滑膜组织形态学变化，免疫组织化学法检测IL-17在关节滑膜的的定位和表达。
　　结果:
　　1.与模型组比较，NTAP组关节炎评分明显改善（P＜0.01）;X光检查评分有差异。
　　2.HE染色结果显示，对照组大鼠滑膜由1～2层扁平滑膜细胞及滑膜下层组成，无炎性细胞浸润及纤维增生。规整平滑，细胞间连接紧密，方向一致。与对照组大鼠滑膜相比，CIA大鼠滑膜内衬层细胞增殖，层数增多，细胞间隙增宽，排列紊乱，呈现典型的栅栏样结构，衬里下层区域多种炎性细胞弥漫性浸润，血管增生明显，结缔组织脂肪细胞增多。和模型组大鼠相比，NTAP组大鼠滑膜层数减少，排列趋于整齐，炎性细胞浸润和滑膜增生减少。与对照组大鼠滑膜相比，模型组滑膜组织中IL-17表达明显升高(P＜0.01）。与模型组比较，NTAP组IL-17表达明显降低(P＜0.01)，原型肽组和无关肽组亦明显降低（P＜0.01）。
　　结论:NTAP可明显改善关节炎指数，改善滑膜病理和跖骨损伤，降低滑膜组织IL-17表达，表明NTAP对胶原诱导关节炎大鼠具有一定的治疗作用。
　　第二部分、非T细胞结合肽对胶原诱导关节炎大鼠辅助性T细胞亚群的影响
　　目的:观察NTAP对胶原诱导关节炎大鼠辅助性T细胞亚群和相关细胞因子与转录因子的影响，并探讨其作用机制。
　　方法:采用流式细胞术测定脾脏中Th1、Th2、Th17和Treg的细胞水平。RT-PCR法测定脾脏中Th1、Th2、Th17、Treg相关的主要转录因子T-bet、Gata-3、RORγt及Foxp3 mRNA的表达，以及Th1、Th2、Th17、Treg标志性细胞因子IFN-γ、 IL-4、IL-17、TGF-β的mRNA表达。
　　结果:
　　1.与对照组比较，模型组Th1、Th17细胞比例及Th1/Th2细胞比值明显升高，Th2、Treg细胞比例明显降低(P＜0.01);与模型组比较，NTAP组Th1、Th17细胞比例及Th1/Th2细胞比值明显降低，Treg细胞比例明显升高(P＜0.01)，原型肽组Th2细胞明显升高，Th17细胞明显降低(P＜0.05)，无关肽组Th17细胞明显降低(P＜0.01)。
　　2.与对照组比较，模型组大鼠脾脏中IFN-γ、IL-17、IL-4 mRNA表达明显升高，TGF-β mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与模型组比较，NTAP组大鼠脾脏中IFN-γ、IL-17 mRNA表达明显降低(P＜0.01)，IL-4、TGF-βmRNA表达明显升高(P＜0.05，P＜0.01);与模型组比较，原型肽组大鼠脾脏中IL-17 mRNA表达明显降低(P＜0.01)，无关肽组大鼠脾脏中IL-17mRNA表达也明显降低(P＜0.01)。
　　3.与对照组比较，模型组大鼠脾脏中T-bet、RORγt mRNA表达明显升高，Gata-3、Foxp3 mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与模型组比较，NTAP组大鼠脾脏中T-bet、RORγt mRNA表达明显下调，Gata-3、Foxp3mRNA表达明显上升(P＜0.01);原型肽组大鼠脾脏细胞中T-bet、Foxp3mRNA表达明显降低(P＜0.01)，RORγt mRNA表达与模型组大鼠比较没有差异，而Gata-3 mRNA表达明显升高(P＜0.01);无关肽组大鼠脾脏中RORγt mRNA表达明显下降(P＜0.01)。
　　结论:NTAP可调节大鼠脾脏T细胞Th1、Th2、Th17及Treg四种亚型的比例，抑制CD4+T细胞向Th1和Th17细胞分化，促进其向Th2和Treg细胞分化。下调Th1、Th17细胞的主要转录因子T-bet、RORγt和标志性细胞因子IFN-γ、IL-17的mRNA表达;上调Th2、Treg主要转录因子Gata-3、Foxp3及Th2、Treg标志性细胞因子IL-4、TGF-β mRNA的表达，表明NTAP对机体的辅助性T细胞亚群有一定的免疫调节作用。
　　第三部分、非T细胞结合肽对胶原诱导关节炎大鼠滑膜组织和脾脏T淋巴细胞凋亡的影响
　　目的:观察NTAP对胶原诱导关节炎大鼠滑膜组织和脾脏T淋巴细胞凋亡的影响，从凋亡途径探讨NTAP对CIA大鼠的作用及其机制。
　　方法:采用TUNEL法检测滑膜细胞凋亡率，免疫组织化学法检测Bcl-2和Bax在滑膜组织中的定位和表达，采用流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞凋亡率。
　　结果:
　　1.TUNEL法检测滑膜细胞凋亡率结果显示，与对照组比较，模型组大鼠测滑膜细胞凋亡率明显降低(P＜0.01）;与模型组比较，NTAP组大鼠滑膜细胞凋亡率明显增加(P＜0.01)，无关肽组凋亡率明显增加（P＜0.05）。
　　2.免疫组化检测结果显示，Bcl-2和Bax蛋白阳性染色呈棕黄色，主要在滑膜细胞胞浆表达;对照组可见少量的Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞;与对照组比较，模型组滑膜组织Bcl-2阳性细胞表达数目明显增多(P＜0.01)，Bax阳性细胞表达明显减少(P＜0.05）;与模型组比较，NTAP组大鼠滑膜组织Bax阳性细胞数明显增多，Bcl-2阳性细胞数明显减少(P＜0.01)。
　　3..流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠脾脏CD3+淋巴细胞凋亡率明显降低(P＜0.05）;与模型组比较，NTAP组脾脏CD3+淋巴细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)。
　　结论:NTAP可以明显提高胶原性诱导性关节炎大鼠的滑膜细胞凋亡率，减弱Bcl-2表达，增强Bax蛋白表达。NTAP对脾脏CD3+淋巴细胞的凋亡率亦有改善作用。
　　小结:
　　1.NTAP可明显降低关节炎指数，缓解大鼠足爪肿胀，改善滑膜病理，降低滑膜组织IL-17表达，表明NTAP对胶原诱导关节炎大鼠具有一定的治疗作用。
　　2.NTAP可以调节大鼠脾脏T细胞Th1、Th2、Th17及Treg四种亚型的比例，抑制CD4+T细胞向Th1和Th17细胞分化，促进其向Th2和Treg细胞分化。下调Th1、Th17细胞的主要转录因子T-bet、RORγt和标志性细胞因子IFN-γ、IL-17的mRNA表达;上调Th2、Treg主要转录因子Gata-3、Foxp3及Th2、Treg标志性细胞因子IL-4、TGF-β的mRNA表达，表明NTAP对机体的辅助性T细胞亚群有一定的免疫调节作用。
　　3.NTAP可以明显提高胶原性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡率，减弱Bcl-2表达，增强Bax蛋白表达。NTAP对脾脏CD3+淋巴细胞凋亡率亦有改善作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 非T细胞结合肽对胶原诱导关节炎大鼠的治疗作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 非T细胞结合肽对胶原诱导性关节炎大鼠辅助性T细胞亚群的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 非T细胞结合肽对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织和脾脏T淋巴细胞凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 辅助性Th17细胞及相关细胞因子与类风湿关节炎

致谢

个人简历