空肠弯曲菌致豚鼠不同时间段周围神经病理损伤的研究

摘要

目的：
　　1、通过经消化道感染空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni），构建豚鼠周围神经损伤模型。
　　2、观察豚鼠经消化道感染空肠弯曲菌后，不同时间段内周围神经的病理损伤有何差异，从而为建立空肠弯曲菌相关的周围神经病的动物模型提供参考依据。
　　方法：
　　1、制备空肠弯曲菌菌悬液
　　选取自AMAM型GBS患者粪便中分离、培养的空肠弯曲菌lulei株，经中国和美国疾病预防控制中心鉴定为空肠弯曲菌。将该菌在42℃微需氧条件下(10％CO2、5％O2、85％N2)培养24小时后传代至哥伦比亚血平板培养基上，培养24小时，并连续传至第3代纯化菌株。并经革兰氏染色、马尿酸水解实验以及分子生物学进行细菌鉴定后，收取菌株制备成浓度为3×109CFU/ml的菌悬液。
　　2、实验动物分组
　　购买SPF级4周龄Hartley豚鼠55只，饲养一周。按照体重、体重增长速度及毛色等条件筛选出50只健康豚鼠。将筛选出的50只健康豚鼠，随机分为布氏肉汤组A（10只）、空白对照组B（10只）、实验组E(30只)。
　　根据不同的解剖时间（末次灌喂后第1、2、3、4、5周）将布氏肉汤组和对照组再次随机分成5个亚组（各2只），布氏肉汤组A分别标记为A1、A2、A3、A4、A5;空白对照组B分别标记为B1、B2、B3、B4、B5;
　　根据不同的解剖时间（末次灌喂后第1、2、3、4、5周）将实验组30只豚鼠再次随机分为5个亚组（各6只），分别标记为E1、E2、E3、E4、E5组。
　　若豚鼠出现瘫痪等明显的临床症状，因实验组的干预处理是统一的，可以将发生瘫痪的豚鼠合并为一组，标记为实验组T。筛选后余下的5只豚鼠继续饲养，设为备用对照组，其中3只处理同布氏肉汤组，2只同空白对照组。
　　3、造模方案
　　实验组（E组）豚鼠给予灌喂活菌菌悬液，每只豚鼠在每次灌喂前禁食15小时、禁水4小时。每周中连续3天进行灌喂菌液（1次/天），共进行三周，每周的灌喂时间相同。每只豚鼠灌喂完毕后，间隔半小时后立即给予食物及无菌水。实验组每只豚鼠每次灌喂3109CFU/ml的空肠弯曲菌菌悬液1ml;A组（布氏肉汤对照组）给予灭菌的布氏肉汤1ml;B组（空白对照组）不予处理。
　　4、实验动物观察及标本取材
　　自灌喂当日起每日观察豚鼠的临床症状（参考Hartley豚鼠EAN模型的评分标准，发病程度分为0～5级。0级:正常;1级:两后脚趾稍拖拽地面;2级:两后脚趾明显拖地;3级:两后肢显著拖地，两后肢偏向同一侧;4级:两后肢完全瘫痪;5级:四肢均瘫痪，甚至呼吸抑制[1]），定期称量豚鼠体重，观察豚鼠的活动能力、精神状况以及皮毛色泽，有无腹泻等。
　　于末次灌喂后第1，2，3，4，5周分批解剖相应的组别A1、B1、E1, A2、B2、E2, A3、B3、E3, A4、B4、E4, A5、B5、E5组。4％水合氯醛（10ug/g）麻醉豚鼠，灌注解剖后，分别取同侧坐骨神经近端保存于4％多聚甲醛中，择期进行锇酸染色观察周围神经病变。
　　5、数据统计分析
　　每个实验标本经锇酸染色后，随机挑选100根神经单丝，于光镜下进行观察，统计出有病变的神经单丝个数，计算出发病率（病变单丝数/100*100％），采用统计学软件SPSS13.0根据病变率进行x2检验。
　　结果：
　　1、实验动物观察
　　1.1临床症状
　　豚鼠经空肠弯曲菌灌喂结束后，实验组中共有6只豚鼠发病，其中4只在灌喂结束后即刻出现瘫痪，2只在灌喂结束后第4周出现瘫痪。均表现为活动力减弱，双耳及唇部紫绀，呼吸急促，身体略有颤抖，双后肢行动差，腹部皮毛脏。自发病后当天进行麻醉豚鼠，灌注解剖取材。并将瘫痪的豚鼠合并为一组，标记为实验组T，根据临床症状评分标准进行评分均为4-5级。其它实验组豚鼠略有脱毛现象，肢体活动未见明显异常，根据临床症状评分标准进行评分均为0级(Fig.5)。
　　1.2体重
　　自灌喂细菌后，实验组豚鼠体重略低于对照组，但是经重复测量单因素方差分析后，实验组豚鼠体重和对照组无显著差异，P＞0.05，(Fig.6)。2周围神经病理表现
　　对照组豚鼠坐骨神经纤维也存在纤维粗细不等，皱缩等现象(Fig.7);
　　各实验组中豚鼠坐骨神经均有纤维粗细不等，髓鞘向内侧突起、节段性消失、皱缩、断裂;髓鞘内有卵圆状物质沉积，节旁区和郎飞结处多见;髓鞘外侧成锯齿样，呈“长城样”改变(Fig.8)。
　　3、神经纤维病变率及统计分析:
　　3.1神经纤维病变率
　　对照组豚鼠神经单丝病理存在形态上的异常，但是实验组和对照组豚鼠周围神经的形态存在显著性差异(P＜0.05)，即实验组豚鼠的神经单丝存在病变。
　　实验瘫痪组豚鼠神经病变率为42.0％，实验组E1、E2、E3、E4、E5组病变率分别为15.3％，18.0％，29.0％，39.0％，38.7％(Table2)。
　　3.2病变率统计分析
　　布氏肉汤组和空白对照组豚鼠神经纤维病变率无统计学差异，P＞0.05(Table3)，可排除布氏肉汤对神经纤维的影响。
　　不同时间段解剖的空白对照组及布氏肉汤组豚鼠神经纤维病变率无统计学差异，P＞0.05(Table4)，可认为不同的时间段解剖豚鼠对神经病变率无影响。
　　不同时间段解剖的实验组豚鼠神经纤维病变率有统计学差异，P＜0.05(Table5)。认为不同时间段解剖的实验组之间发病率不全相等，进一步进行组间比较，采用x2分割法，检验水准取α=0.05，校正后检验水准α'=0.0033。
　　通过spss13.0曲线拟合方法得出实验组豚鼠病变率和时间存在一定的依存关系(Table6)。结合x2分割组间比较，可得出豚鼠经活菌灌喂后第4周(E4)神经病变率和瘫痪组(T)豚鼠神经病变率无差异，且此两阶段神经病变率较其它时间段解剖的实验组高。
　　结论：
　　1、自AMAN型GBS患者粪便中分离培养的空肠弯曲菌经消化道感染4周龄豚鼠能够导致豚鼠周围神经损伤，但并不是所有的神经单丝都有损伤，存在一定的病变率;部分豚鼠出现瘫痪等临床症状。
　　2、在空肠弯曲菌导致4周龄豚鼠的周围神经病损伤模型中，不同时间段内神经损伤统计率不同，瘫痪组豚鼠以及灌喂结束后第4周豚鼠神经损伤率比较严重。

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结论

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综述 吉兰-巴雷综合征

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