CCK-8对LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞内质网应激的影响

摘要

目的:炎症是组织对各种损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。而炎症失控是感染性疾病并发多器官功能障碍（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的主要发病机制，单核-巨噬细胞的活化在诱导炎症反应中起关键作用。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或其它致炎因素作用下，单核巨噬细胞生成并释放大量的促炎因子，包括IL-1β、IL-6等，这些促炎因子的过度释放可引起机体自身组织损伤，导致全身性炎症反应综合征，最终导致MODS甚至死亡。因此，有效控制单核巨噬细胞的过度激活将对减轻机体炎症反应起到积极的保护作用。
　　内质网是真核细胞蛋白质合成的主要场所，对应激原的刺激十分敏感。各种应激原作用后通过诱发内质网腔中错误折叠和未折叠蛋白的堆积而激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)及细胞凋亡等内质网反应，导致内质网功能紊乱，引发内质网应激(Endoplasmic reticulumstress，ERS)。有研究发现，ERS在LPS诱导巨噬细胞的炎症反应中发挥关键作用，LPS攻击巨噬细胞可引起内质网腔内错误折叠及未折叠蛋白质增多，内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(78-kDa glucose-regulatedprotein，GRP78)转而与之结合，释放肌醇需要元件-1(inositol requiringelement-1，IRE1)，IRE1活化切割转录因子X盒结合蛋白1(X-box bindingprotein1，XBP1)mRNA，使XBP1mRNA由无活性形式转为活性形式，翻译成XBP1蛋白，作用于内质网应激反应元件(ER stress responseelement，ERSE)，促进C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)基因的转录和表达，CHOP表达增高，可激活半胱天冬蛋白酶-11/半胱天冬蛋白酶-1(caspase-11/ caspase-1)信号通路，促进IL-1β的生成，诱发炎症相关性疾病。因此控制ERS的程度对抑制LPS诱导的炎症反应具有重要意义。胆囊收缩素（cholecystokinin， CCK）是一类广泛存在于体内多个系统的脑-肠肽，参与多种生物学功能的调节，如神经-体液调节、记忆及摄食调节等。CCK在体内存在多种形式，其中八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octopeptide，CCK-8)是存在于小肠、血液及中枢神经系统内最重要的形式。本实验室以往研究发现，八肽CCK（CCK-8）具有一定的抗炎和免疫调节作用，能减轻内毒素休克大鼠肺脏、肝脏、脾脏、肾脏间质水肿及白细胞的浸润等病理损伤，同时抑制体内多种促炎因子的释放。因此CCK-8对于治疗炎症相关性疾病具有较好的应用前景，但CCK-8对LPS诱导的巨噬细胞ERS启动炎症反应信号通路有何调节作用，尚未见文献报道。
　　基于以上研究背景，本实验选择可稳定传代的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞探讨这一科学问题，对于阐明CCK-8的抗炎机制以及药物开发应用具有重要意义。
　　方法:
　　1、选用小鼠单核巨噬细胞（购自中国科学院上海细胞库）RAW264.7细胞作为研究对象。
　　2、实验分组:将小鼠RAW264.7细胞按随机数字表法分为6组:对照组（Con组）:用无血清DMEM/高糖培养基培养;LPS组:用含0.5μg/mlLPS无血清的培养基培养;CCK-8组:用含10-6μmol/ml CCK-8无血清培养基培养;CCK-8+LPS组:预先用含10-6μmol/ml CCK-8处理10min，然后加LPS的无血清培养基处理细胞;CCK-8受体拮抗剂-1+CCK-8+LPS组:(devazepide+CCK-8+LPS):预先在加入CCK-8和LPS前10min加入含10-3M devazepide的无血清培养基培养;CCK-8受体拮抗剂-1组（devazepide组）:用含10-3M devazepide的无血清培养基培养。处理所用药物的剂量和时间均根据预实验结果。
　　3、收集细胞，提取总蛋白，用Western blot方法检测内质网应激标志分子GRP78/Bip、CHOP蛋白的表达情况;提取总RNA，用RT-PCR方法检测RAW264.7细胞内XBP-1s mRNA表达的变化情况;收集细胞上清，采用ELISA技术检测RAW264.7细胞上清中IL-1β的含量。
　　4、数据用均数±标准差(Mean±SD)表示，用SPSS21.0软件进行统计学分析，各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(least significant difference，LSD)作两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、观察不同浓度LPS及LPS处理不同时间对细胞中GRP78、CHOP蛋白表达的影响
　　RAW264.7细胞经不同浓度LPS（0.5、1.0、1.5μg/ml）作用24 h后，GRP78、CHOP的表达与对照组相比均明显增高(P＜0.05)，而经LPS三种浓度处理后GRP78、CHOP的表达水平组间比较无统计学差异，(P＞0.05)。考虑LPS对细胞的毒性作用，所以选择0.5μg/ml作为后续实验的药物浓度。
　　RAW264.7细胞经0.5μg/ml LPS作用不同时间(3、6、12、24h)后，CHOP的表达水平较对照组均有所增加，且CHOP表达量在12h达最高峰(P＜0.05);GRP78/Bip表达与CHOP的表达结果相一致。根据以上结果确定最终的实验条件为0.5μg/ml LPS作用细胞时间为12h。
　　2、观察CCK-8对LPS诱导的RAW264.7细胞XBP1-s mRNA表达的影响
　　XBP1mRNA表达水平升高标志IRE1活化，ERS启动。与对照组相比，LPS组XBP1-s mRNA表达明显增高。与LPS组相比，CCK-8+LPS组XBP1mRNA的表达明显降低(P＜0.05），而预先应用CCK-8的1受体阻滞剂devazepide可明显抑制CCK-8的作用。单独应用CCK-8或devazepide，XBP1mRNA表达水平与对照组相比无明显差异(P＞0.05）。该结果表明CCK-8通过受体1抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IRE1活化。
　　3、观察CCK-8对LPS诱导的RAW264.7细胞GRP78、CHOP蛋白表达的影响
　　GRP78、CHOP是ERS启动的标志性蛋白。与对照组相比，LPS组GRP78、CHOP表达明显增高(P＜0.05）。与LPS组相比，CCK-8+LPS组GRP78、CHOP的表达明显降低(P＜0.05），这一作用可被预先应用CCK-8-1受体阻滞剂devazepide所抑制。单独应用CCK-8或devazepide，GRP78、CHOP表达水平与对照组相比无明显差异，(P＞0.05）。结合XBP1mRNA表达水平变化，本文认为，CCK-8通过受体1抑制LPS诱导的RAW264.7细胞ERS的启动。
　　4、CCK-8抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β释放
　　巨噬细胞CHOP的表达增高可引起IL-1β释放增加。与对照组相比，LPS组IL-1β表达明显增高(P＜0.05），预先给予CCK-8可有效抑制LPS诱导的IL-1β水平升高。而预先应用devazepide可逆转CCK-8的作用(P＜0.05)。IL-1β水平的变化与CHOP蛋白表达水平变化一致，说明CCK-8可通过其1受体降低LPS诱导的RAW264.7细胞ERS，减少IL-1β的生成，减轻炎症反应。
　　结论:
　　CCK-8通过受体1抑制LPS诱导的内质网应激，减少IL-1β的生成，发挥抗炎作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 不同浓度LPS对RAW264-7细胞内GRP78／Bip、CHOP蛋白表达的影响

2 显微镜下观察三种浓度LPS细胞组间形态的变化如下

3 LPS(0．5Ltg／m1)作用不同时间对RAW264．7细胞内GRP78／Bip、CHOP蛋白表达的影响

附图

讨论

结论

参考文献

综述 内质网应激与炎症相关性疾病的研究进展

致谢

个人简历