硼替佐米调控泛素连接酶E3家族成员表达水平对前列腺癌抑制作用的分析

摘要

目的:前列腺癌是危害全世界男性健康的首要恶性肿瘤之一，在欧美等西方国家前列腺癌的年发病率居男性肿瘤的第1位，死亡率居第2位，在我国，前列腺癌发病率已跃居为男性恶性肿瘤的第3位。前列腺癌常为隐匿发病，确诊时多已经发生浸润或转移，其高死亡率及高术后复发率主要与其易转移有关，死于前列腺癌的患者中85％～100％合并远处转移。前列腺癌细胞最远转移部位是骨，晚期前列腺癌骨转移十分常见。大多数发生远处转移的前列腺癌会发展为雄激素非依赖性前列腺癌，因此常规的内分泌治疗效果不理想。目前针对发生远处转移的前列腺癌尚无有效的治疗方法，预后极差，生存期一般短于2年。因此，深入探讨前列腺癌发生机制，找寻治疗前列腺癌关键靶点及切实有效的治疗药物迫在眉睫。泛素连接酶E3具有调控基因转录、稳定质膜蛋白、降解错误蛋白与抑癌因子等多种作用，参与恶性肿瘤发生发展过程。泛素连接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1均包括一个C2区域，2-4个WW区域和一个HECT区域，故具有相似的功能与共同的特性。大量的研究指出泛素连接酶E3家族成员与前列腺癌的发生、迁移、浸润和转移密切相关，如研究发现WWP1在多种侵袭性前列腺癌细胞株中高表达，而且下调WWP1表达水平可导致癌细胞生长抑制。硼替佐米是一种新型泛素-蛋白酶体通路抑制剂，目前主要作为抗多发性骨髓瘤药物应用于临床，虽有研究发现硼替佐米可抑制前列腺癌发生及浸润，且可抑制肿瘤远处转移，但具体量-效关系、时间-效果关系及其作用机制尚不明确，已有资料提示硼替佐米对泛素连接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1表达水平亦有调节作用。本研究旨在分析探讨硼替佐米通过调控泛素连接酶E3 Smurf1、Smurf2及WWP1的表达水平，从而对前列腺癌细胞增殖发挥抑制作用，为Smurf1、Smurf2及WWP1作为前列腺癌治疗新靶点及硼替佐米应用于前列腺癌治疗提供依据。
　　本研究应用一系列实验方法，通过检测药物处理对雄激素非依赖性人前列腺癌PC3细胞株的细胞增殖率、Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA及蛋白表达水平的影响，进而探索硼替佐米对前列腺癌细胞增殖的作用模式及机制。
　　方法:
　　1、细胞培养在严格无菌的环境下，将人前列腺癌PC3细胞接种于含DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基的细胞培养瓶中培养，隔日换液，待细胞汇合度达90～95％时，以胰蛋白酶进行消化，并进行传代培养，待传至3-5代后取细胞进行实验。
　　2、分组
　　2.1空白对照组（不进行任何药物处理）;
　　2.2硼替佐米处理组(硼替佐米浓度梯度设置为:0.5、5、15、25μmol/L，作用时间:24h、48 h，72 h)
　　3、细胞增殖率测定采用Brdu ELISA法测定各组细胞增殖情况及其活性变化。
　　4、细胞泛素连接酶Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平测定硼替佐米处理PC3细胞72小时后，提取细胞内RNA。应用实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR，Real Time-Polymerase Chain Reaction)对各组细胞泛素连接酶WWP1、Smurf1及Smurf2 mRNA水平进行检测。
　　5、细胞泛素连接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平测定硼替佐米处理PC3细胞72小时后，提取蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度。应用Western blotting方法对各组细胞泛素连接酶Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平进行检测。
　　6、统计学方法本研究所得数据均录入SPSS18.0软件进行分析处理，计量资料均以“均数±标准误”表示，应用SNK-t检验法进行两组比较，单因素方差分析AVON进行多组比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　结果:
　　1、Brdu ELISA结果显示:
　　1.1于药物处理后24 h、48 h及72 h三个时间点，相较于对照组，硼替佐米处理组PC3细胞增殖率均显著降低(P＜0.05)，且PC3细胞增殖率与硼替佐米使用剂量负相关，即硼替佐米浓度越高，对PC3细胞增值率抑制作用越强，PC3细胞增值率数值越低，呈现剂量依赖性，且在25μmol/L的浓度下抑制作用最为显著;
　　1.2在药物浓度分别为5、15及25μmol/L的硼替佐米处理组中，PC3细胞增值率与处理时间长短负相关，即硼替佐米处理时间越长，对PC3细胞增值率抑制作用越强，PC3细胞增值率数值越低，呈现时间依赖性。
　　2、Real time-PCR结果显示:
　　经药物处理72 h后，相较于对照组，硼替佐米处理组PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平显著降低(P＜0.05)，且在一定范围内Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平与硼替佐米使用剂量负相关，即硼替佐米浓度越高，PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA转录水平越低，呈现剂量依赖性，且在25μmol/L的浓度下效果最为显著。
　　3、Western blotting结果显示:
　　经药物处理72 h后，相较于对照组，硼替佐米处理组PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)，且在一定范围内Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平与硼替佐米使用剂量负相关，即硼替佐米浓度越高，PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平越低，呈现剂量依赖性，且在25μmol/L的浓度下效果最为显著。
　　结论:
　　1、硼替佐米对雄激素非依赖性人前列腺癌PC3细胞增殖率的抑制作用在一定范围内随着药物浓度、作用时间的增加而增加，并呈剂量-时间依赖性。
　　2、在处理PC3细胞72 h后，硼替佐米可显著降低PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1 mRNA水平(P＜0.05)，且该作用呈现剂量依赖性。
　　3、在处理PC3细胞72 h后，硼替佐米可显著降低PC3细胞中Smurf1、Smurf2及WWP1蛋白表达水平(P＜0.05)，且该作用呈现剂量依赖性。

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材料与方法

结果

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附表

讨论

结论

参考文献

综述 泛素连接酶E3 Nedd4-like家族与癌症关系的研究进展

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