婴儿生后粪便微生物区系的演变

摘要

目的:肠道微生物在营养代谢、免疫系统成熟以及促进肠粘膜屏障的完善中起重要作用，肠道微生物群多样性或结构的改变与多种疾病有关，婴儿时期是肠道微生物群定植、演替的重要阶段，婴儿时期肠道微生物群定植模式可持续至成年。以往对于肠道微生态的研究多采用培养或分子生物学技术，对于肠道微生物群的多样性研究有明显的局限性，随着第二代高通量测序技术的出现，以其测序快、准确度高等特点逐渐应用于肠道微生物的研究，这些研究大多在欧美国家完成，中国此方面文献报道不多，且样本量少，结果差异性较大，不能全面体现婴儿肠道微生物区系的定植及演变全过程。本研究旨在通过Illumina Miseq高通量测序平台对婴儿多个时间段的粪便微生物群进行DNA测序，探讨婴儿生后粪便微生物区系的定植和演变过程，为今后肠道微生物群系变化与远期疾病的发生风险提供理论依据。
　　方法:选择2013年11月-2015年3月在河北医科大学第三医院和石家庄市第四人民医院出生的符合入组标准的新生儿30例，均为阴道分娩、母乳喂养、家中成员无过敏史，母亲围产期未应用抗生素，婴儿及其双亲均生活在石家庄市或其周边县市，气候环境，居住环境，饮食环境等相当。收集其婴儿出生后第1、3、7天，第1个月、3个月和第6个月龄时的粪便标本（分别设定为A-F组），冻存于-80℃冰箱，并随访入组婴儿上述时间段的喂养状况、健康情况及用药情况（抗生素及益生菌制剂）。采用OMEGA E.Z.N.A试剂盒提取粪便标本中DNA，通过Illumina MiseqPE250高通量测序平台对细菌16S rRNA的V3-V4可变区域进行测序，应用Mothur软件对测得序列进行OTU聚类，分析肠道菌群的丰度及多样性，在门及属水平对婴儿生后肠道微生物区系进行详细描述，并结合随访情况，分析出现变异原因。
　　结果:
　　1、入组婴儿30例，收集其婴儿出生后第1、3、7天，第1个月、3个月和第6个月龄时的粪便标本，应收集标本180份标本，但实际收集158个标本，因各种原因脱落22个，脱落率为12％。其中15个粪便标本提取DNA失败，11个标本扩增失败，共计132个粪便标本进入测序程序，测得总序列5143376，总碱基数3096312352bp，经过滤及筛选后，共获得优化序列为2717040，总碱基数为1206679948bp，平均长度444.12bp。
　　2、对测得序列进行随机抽样，以抽到的序列数与所代表OTU的数目构建稀释曲线，此曲线趋于平坦，说明所测序数据量合理，测序深度足够，能覆盖肠道菌群97％的菌种。通过Chao1指数、ACE指数随着时间的推移逐渐增大，显示粪便微生物丰度逐渐增多，Shannon指数逐渐增大、Simpson指数逐渐减小提示生后随时间推移，粪便样本中菌群多样性逐渐增加。
　　3、对132个粪便标本进行测序，共测得17个门，181个属。其中在门水平上，占微生物区系99％的有5个门，分别为Proteobacteria（变形菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）Bacteroidetes（拟杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）Fusobacteria（梭菌门）。主要属包括:Bifidobacterium（双歧杆菌属）、Lactococcus(乳球菌属)、Pseudomonas(假单胞菌属)、Enterococcus(肠球菌属)、Escherichia-Shigella（大肠埃希菌-志贺菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）Klebsiella（克雷伯氏菌属）Psychrobacter（嗜冷杆菌属）等，共计181个属。
　　4、婴儿肠道微生物群定植及演变过程:
　　4.1婴儿出生后随时间段推移，门水平上变化:Proteobacteria（变形菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）含量呈下降趋势，Proteobacteria从出生第一天的46.5％，经过6个月后下降至24％; Firmicutes从出生第一天的45.3％，经过6个月后下降至23.3％。与之相反，婴儿出生后Actinobacteria（放线菌门）含量随时间段推移呈明显上升趋势，由出生时的3.4％上升至6个月时的45.7％。
　　4.2婴儿出生后随时间段推移，属水平上变化:生后第1天肠道菌群主要由Lactococcus（乳球菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属）组成，第3天肠道菌群个体差异较大，有多种需氧菌及兼性厌氧菌定植，如Enterococcus(肠球菌属)、Escherichia-Shigella（大肠埃希菌-志贺菌属），且Lactococcus（乳球菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属）急剧减少，第7天时双歧杆菌定植增多，标本间差异较大，生后1月时，所有标本都出现双歧杆菌的定植，且迅速增长成为优势菌属，平均达30％-40％，生后3个月时，各标本间菌群定植趋于相似，双歧杆菌的定植更多，能达到40％-60％，主要有Bifidobacterium(双歧杆菌)、Escherichia-Shigella（大肠埃希菌-志贺菌），生后6月时有的个体添加辅食后双歧杆菌数量减少，未添加辅食的个体双歧杆菌与3月时基本一致。
　　5、PCA分析显示(1)组间相似性分析:A组与各组存在明显差异。其余各组无明显聚集，各组微生物构成差异较大。(2)所有个体相似性分析，可见A组菌群个体内较相似，但与其他时间点差异较大，随喂养时间的延长，肠道菌群发生改变。但是从个体角度分析，A组样品相似度较高，B、C组个体相对集中，D组和E组个体间差异较大，F组个体又呈现菌群相似的趋势。
　　6、变异分析:各组均出现变异个体，结合随访信息发现，母乳不足婴儿以大肠杆菌定植为主，腹泻婴儿以大肠杆菌、梭菌属等定植为主，应用抗生素婴儿出新生儿期以葡萄球菌定植，以后持续大肠杆菌定植。可见喂养方式、腹泻、抗生素应用对婴儿肠道微生物定植的多样性及结构都产生影响，为以后多因素分析提供依据。
　　结论:
　　1、Illumina Miseq测序平台能够测序肠道中所有微生物DNA序列，全面分析肠道微生物落的多样性和丰度，满足对肠道微生物群落的全面认识。
　　2、足月健康、母乳喂养、阴道分娩儿肠道微生物区系:
　　2.1共测得17个门，占微生物区系99％有5个门，分别为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、梭菌门。
　　2.2共测得181个属，主要的属大致有:双歧杆菌属、乳球菌属、假单胞菌属、肠球菌属、大肠埃希菌-志贺菌属、葡萄球菌属、克雷伯氏菌属、嗜冷杆菌属等。
　　3、足月健康、母乳喂养、阴道分娩儿肠道微生物区系的演替:3.1在门水平上，出生时变形菌门及厚壁菌门是优势菌种，随着时间的推移，变形菌门及厚壁菌门逐渐下降，放线菌门增长迅速，至6个月时为优势菌门。
　　3.2在属水平上，出生时肠道微生物主要由乳球菌属和假单胞菌属组成，随着时间的推移，乳球菌属和假单胞菌属急剧减少，第7天时双歧杆菌属定植增多，生后1月时双歧杆菌属迅速增长成为优势菌属，持续至添加辅食，随着辅食的添加双歧杆菌属数量减少，大肠杆菌属增多。
　　4、足月健康、母乳喂养、阴道分娩儿肠道微生物区系的变异分析:从肠道微生物区系的变异标本分析，喂养方式、抗生素应用，以及患有感染性疾病可对婴儿肠道微生物定植的多样性及结构产生影响。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 肠道菌群的定植模式与远期过敏性疾病发生风险

致谢

个人简历