淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因模型小鼠脑铁超载的干预作用及其机制研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是临床上常见的一种老年性痴呆综合症，病理特征主要包括神经元间β淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉积形成老年斑、过磷酸化tau蛋白为核心形成神经元内神经纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)、特定脑区选择性神经元丢失和胶质细胞过度炎症反应。随着世界人口老龄化程度的不断升高，AD的发病率也将不断上升。据统计，截止2005年全球有2430万人患痴呆，每年新增痴呆病例460万。我国的痴呆人数已近800万，其中AD近600万。这将对家庭以致社会造成越来越沉重的负担，因此，对AD的致病机理及预防治疗策略的研究显得尤其迫切。
　　近年来，研究发现AD患者的脑铁水平异常升高，这可能与某些脑组织铁代谢相关蛋白表达失控有关。异常增高的脑铁启动机体级联放大机制，最终导致神经元死亡，在AD的发生发展中发挥重要作用。因此，降低增高的脑铁是防治AD的一个有效方法。临床研究发现肌肉注射去铁胺（desferrioxamine，DFO）可改善患者的临床症状及生活自理能力，但因其毒副作用强、口服效果差等缺点限制了其临床应用。从中药提取的有效成分具有多重功效，可以抑制AD脑铁超载，缓解脑铁超载带来中枢神经系统功能衰退，这为提高AD患者的生活质量，以及实现健康老龄化均具有重要的科学、经济和社会意义。因此，本课题从中药有效成分复方对AD神经元脑铁超载的干预效应和作用环节为切入点，揭示中药防治AD的可能机制，为临床防冶AD提供科学依据。
　　第一部分淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠学习记忆能力的影响
　　目的:观察淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对APPswe/PS1dE9(APP/PS1)双转基因AD模型小鼠的学习记忆能力的影响。
　　方法:9月龄雄性APP/PS1双转基小鼠108只，随机分为模型组、淫羊藿组、黄芪组、葛根组、复方组和DFO组，9月龄雄性C57BL/6J(C57)小鼠18只作为阴性对照组。淫羊藿组小鼠灌胃给予淫羊藿苷，黄芪组小鼠灌胃给予黄芪甲苷，葛根组灌胃给予葛根素，复方组灌胃给予淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方，模型组和阴性对照组给予等量生理盐水。灌胃结束后，采用Morris水迷宫检测各组小鼠学习记忆能力情况。
　　结果:水迷宫定位航行实验结果显示，在测试的5天内所有小鼠的逃避潜伏期都表现为缩短趋势。AD模型组与C57组相比，AD模型组逃避潜伏期明显延长（P＜0.05），复方组和DFO组逃避潜伏期均值较各单方组及模型组明显下降，与AD模型组相比明显缩短(P＜0.05），但未达到正常水平，复方组和DFO组相比无明显差异（P＞0.05）。各组小鼠的平均游泳速度均无明显差异（P＞0.05）。空间探索实验结果显示，监测撤去平台后各组小鼠跨平台次数和各组小鼠在原平台象限的活动时间以及搜索策略，与C57组小鼠相比，AD模型组小鼠在原平台所处象限搜索时间明显降低(P＜0.05)，搜索能力测试中跨过原平台所在位置的次数也显著减少(P＜0.05），搜索策略评分明显降低(P＜0.05)，复方组小鼠和DFO组小鼠在原平台所在象限搜索时间、跨平台次数及搜索策略评分均较模型组显著升高和增加（P＜0.05），但未恢复至正常水平，复方组小鼠和DFO组小鼠相比无明显差异。
　　结论:APP/PS1双转基因AD模型小鼠能够较好的模拟AD患者学习记忆能力降低的表现，提供有效的实验动物模型。淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方可以有效的改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠的学习记忆能力。
　　第二部分淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠大脑皮质病理学及超微结构的影响
　　目的:观察淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对APP/PS1双转基因AD模型小鼠大脑皮质病理学及超微结构的影响。
　　方法:9月龄雄性APP/PS1双转基小鼠36只，随机分为模型组、淫羊藿组、黄芪组、葛根组、复方组和DFO组，9月龄雄性C57小鼠6只作为阴性对照组。淫羊藿组小鼠灌胃给予淫羊藿苷，黄芪组小鼠灌胃给予黄芪甲苷，葛根组灌胃给予葛根素，复方组灌胃给予淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方，模型组和阴性对照组给予等量生理盐水。用药结束后，采用尼氏染色、Bielschowsky银染及透射电镜技术观察各组小鼠大脑皮质的病理学改变。
　　结果:尼氏染色结果显示，对照组小鼠大脑皮质各区神经细胞排列整齐且密集，胞浆中尼氏体丰富，大脑皮质尼氏小体呈深蓝色，细胞核淡蓝色;模型组小鼠大脑皮质神经元水肿，细胞数量减少，排列稀疏，细胞间隙增大，胞浆内尼氏体减少，分界不清，染成淡蓝色;淫羊藿组、黄芪组、葛根组小鼠较模型组小鼠神经元水肿有所减轻，细胞数量略有增加。复方组和DFO组小鼠大脑皮质神经细胞排列整齐且密集，胞浆中尼氏体丰富，水肿明显改善，细胞数量增加明显;
　　改良Bielschowsky银染结果显示，C57对照组小鼠大脑皮质神经元排列整齐、密集，未见老年斑。模型组小鼠大脑皮质可见大量的老年斑，淫羊藿组、黄芪组和葛根组仍可见一定数量的老年斑，复方组小鼠及DFO组小鼠大脑皮质与模型组相比老年斑数量减少，说明淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方可以减少APP/PS1转基因模型小鼠大脑皮质老年斑的沉积，且其效果较单方组更优。
　　透射电镜结果显示，正常对照组小鼠皮质神经元形态正常，呈椭圆形，结构清晰;细胞核形态正常，染色质分布均匀，核仁大小正常;细胞膜及核膜完整;各细胞器形态完整，结构正常，粗面内质网排列呈板层状，多聚核糖体丰富，高尔基体形态正常，线粒体呈椭圆形，脊完整。模型组小鼠皮质神经元出现严重的变性和坏死，广泛水肿、膜结构通透性增高，失去正常形态，大量神经元体积变小，形态不规则。细胞核形态改变，分叶，核膜凹陷形成核裂，染色质浓缩边集，部分细胞核固缩，碎裂，溶解，核仁消失;细胞器肿胀崩解，内质网脱颗粒，多聚核糖体解聚，游离核糖体增多，高尔基体囊泡扩张，线粒体肿胀畸形，线粒体脊溶解断裂;大量神经元内细胞器形态消失，胞浆内大量脂褐素。淫羊藿组、黄芪组和葛根组小鼠皮质神经元在透射电镜下观察超微结构较为相似，部分神经元形态不规则，出现水肿，失去正常形态。部分细胞核形态改变，分叶，核膜凹陷形成核裂，染色质浓缩边集，部分细胞核固缩，碎裂，溶解，核仁消失;可见少量神经元细胞器肿胀崩解，内质网脱颗粒，多聚核糖体解聚，游离核糖体增多，高尔基体囊泡扩张，线粒体肿胀畸形，线粒体脊溶解断裂;部分神经元内细胞器形态消失;胞浆内可见脂褐素。复方组和DFO组小鼠皮质神经元在透射电镜下观察超微结构较为相似，神经元形态接近正常对照组小鼠，形态较为规则。细胞核形态完整，膜结构正常，染色质分布较为均匀，细胞器形态较为完整，结构较为正常，多聚核糖体较为丰富，有少量的游离核糖体，胞浆内可见少量脂褐素。
　　结论:淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方能减少APP/PS1转基因模型小鼠大脑皮质老年斑的沉积，降低神经元的损伤。
　　第三部分淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠脑铁含量的影响
　　目的:淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠脑铁含量的影响研究
　　方法:9月龄雄性APP/PS1双转基小鼠36只，随机分为模型组、淫羊藿组、黄芪组、葛根组、复方组和DFO组，6月龄雄性C57小鼠6只作为阴性对照组。淫羊藿组小鼠灌胃给予淫羊藿苷，黄芪组小鼠灌胃给予黄芪甲苷，葛根组灌胃给予葛根素，复方组灌胃给予淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方，模型组和阴性对照组给予等量生理盐水。用药结束后，采用脑组织铁化学染色法和石墨炉原子吸收光谱技术检测各组小鼠大脑皮质铁含量。
　　结果:组织铁化学染色结果显示，各组小鼠大脑皮质细胞胞浆内均可见蓝色铁颗粒沉积，统计蓝色铁颗粒个数发现:AD模型组与C57组相比，AD模型组蓝色铁颗粒沉积明显增多（P＜0.05），结果提示APP/PS1双转基因小鼠学大脑皮质内存在铁超载。与AD模型组相比，淫羊藿组、黄芪组、葛根组、复方组和DFO组铁颗粒沉积明显减少(P＜0.05），复方组和DFO组与各单方组各组小鼠相比，铁颗粒沉积明显减少(P＜0.05)，复方组和DFO组相比无明显差异（P＞0.05）
　　石墨炉原子吸收光谱检测小鼠脑铁含量结果显示:与C57组小鼠相比，AD模型组小鼠脑铁含量明显升高（P＜0.05），结果提示APP/PS1双转基因小鼠学大脑皮质内存在铁超载。与AD模型组相比，黄芪组、葛根组、复方组和DFO组脑铁含量明显降低(P＜0.05），复方组和DFO组与各单方组各组小鼠相比，脑铁含量明显降低(P＜0.05），复方组和DFO组相比无明显差异（P＞0.05）
　　结论:AD模型组小鼠脑铁含量明显升高，应用淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方可以有效的降低脑铁含量。
　　第四部分淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠大脑皮质DMT1、FPN1表达的影响
　　目的:观察淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对APP/PS1双转基因小鼠大脑皮质DMT1、FPN1表达的影响，探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方干预阿尔茨海默病小鼠脑铁超载的作用机制。
　　方法:9月龄雄性APP/PS1双转基小鼠36只，随机分为6组，模型组、淫羊藿组、黄芪组、葛根组、复方组、DFO组，9月龄雄性C57小鼠6只作为正常对照组。淫羊藿组小鼠灌胃给予淫羊藿苷水溶液，黄芪组灌胃给予黄芪甲苷水溶液，葛根组灌胃给予葛根素水溶液，复方组灌胃给予淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方，DFO组肌肉注射DFO，模型组和阴性对照组小鼠灌胃给予等量生理盐水。灌胃结束后，取各组小鼠脑组织，分别采用免疫组化，Real time PCR和Western方法检测各组小鼠大脑皮质DMT1和FPN1的表达情况。
　　结果:免疫组化结果显示:阴性对照组均未见DMT1及FPN1阳性细胞。与正常对照组相比，模型组DMT1的表达增高，模型组FPN1的表达降低;与模型组相比，复方组和DFO组DMT1的表达降低，模型组和DFO组FPN1的表达增高;与DFO组相比，复方组DMT1和FPN1的表达无明显差异。Real time PCR结果显示:与正常对照组相比，模型组DMT1mRNA的表达均增高，模型组FPN1 mRNA的表达降低;与模型组相比，复方组和DFO组DMT1 mRNA的表达均降低，模型组和DFO组FPN1mRNA的表达增高;与DFO组相比，复方组DMT1和FPN1 mRNA的表达无明显差异。Western结果显示:与正常对照组相比，模型组DMT1-withIRE和DMT1-without IRE的表达均增高，模型组FPN1的表达降低;与模型组相比，复方组和DFO组DMT1-with IRE和DMT1-without IRE的表达均降低，模型组和DFO组FPN1的表达增高;与DFO组相比，复方组DMT1-with IRE、DMT1-without IRE和FPN1的表达无明显差异。
　　结论:淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方可以下调AD小鼠大脑皮质DMT1的表达，上调AD小鼠大脑皮质FPN1的表达，从而抑制AD小鼠脑铁超载，缓解铁超载带来的中枢神经系统功能衰退。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠学习记忆能力的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠大脑皮质病理学及超微结构的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠脑铁含量的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分 淫羊藿、黄芪、葛根有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠大脑皮质DMT1、FPN1表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 阿尔茨海默病发病机制研究进展

综述二 阿尔茨海默病转基因动物模型研究进展

致谢

个人简历