TET1在人乳腺癌组织中的表达及其调节MCF-7细胞株生物学行为的研究

摘要

目的:乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤。临床上，肿瘤病人的死亡90％是由于肿瘤的复发转移引起的。因此，探究乳腺癌发生、发展、浸润及转移的分子生物学机制是现今的研究热点。TET1是近年来发现的促进DNA去甲基化过程的重要蛋白，可通过催化5-甲基胞嘧啶(5mC)进一步转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)参与DNA去甲基化和基因表达的调控。已有一些研究证实，在人类实体肿瘤中TET基因突变与5hmC水平的改变与肿瘤的发生、发展、预后有着显著相关性，但其具体作用机制众说不一。
　　为此，本研究首先通过检测乳腺癌组织及良性乳腺病变组织中TET1的表达情况，探究TET1与乳腺癌临床病理特点之间的关系;随后测定了TET1在不同乳腺癌细胞系中的表达情况;最后通过建立高表达TET1的MCF-7细胞株，研究TET1对MCF-7细胞增殖、细胞周期及迁移能力的影响，并初步探究其相关分子机制，以期为临床治疗肿瘤提供新的靶点。
　　方法:
　　1、随机收集2012年1月至2014年6月河北医科大学第四医院乳腺中心收治的原发性乳腺癌患者62例，并收集乳腺良性病变患者10例作为对照组。随后于我院病理科采用免疫组化Max Vision TM一步法检测所有患者术后病理组织的TET1表达，结合患者年龄、术后的肿瘤大小、淋巴结状态、病理学分期、组织学分级、是否有脉管瘤栓、分子分型及ER、PR、HER-2、P53及Ki-67的表达情况，探讨TET1的表达与乳腺癌临床病理特点的关系。
　　2、应用PCR及Western blot检测SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453四种乳腺癌细胞系中TET1的表达情况，并以非肿瘤源性肾上皮细胞HEK293及脐带间充质干细胞(hmsc)作为对照进行比较分析。
　　3、应用质粒转染方法，建立TET1高表达稳转细胞株(MCF-7-TET1)及携带eGFP的阴性对照组稳转细胞株（MCF-7-vector），CYBRGreen法实时定量PCR检测TET1在转录水平的表达状况。
　　4、倒置显微镜下观察转染细胞的形态，以MCF-7-vector作为阴性对照，以MCF-7作为空白对照，应用CCK-8法检测高表达TET1对MCF-7细胞增殖的影响，应用流式细胞学技术检测TET1对细胞周期的影响，利用细胞划痕实验检测TET1对细胞迁移能力的作用，并应用qPCR检测EMT相关基因（CDH1、VIM、TGFB1、CTNNB1）在转录水平的表达。
　　5、应用SPSS19.0统计进行数据分析，免疫组化结果采用卡方检验及Spearman相关性检验。两独立样本的比较应用成组t检验分析，多组间均数比较应用单因素方差分析，多样本均数间多重比较应用Tukey检验，数据用mean±SD表示，每组实验不少于3个独立样本的重复，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　结果:
　　1、在62例原发性乳腺癌标本中，TET1低表达者共33例，高表达者共29例，原发性乳腺癌中的TET1低表达率为53.23％;在10例乳腺良性病变标本中TET1低表达者0例，高表达者共10例，乳腺良性病变的TET1低表达率为0％。TET1在原发性乳腺癌组织及乳腺良性病变中的表达差异有统计学意义，x2=7.799，P=0.005。
　　2、根据肿瘤大小，将62例原发性乳腺癌患者分为＜2cm组，共32例，＞2cm组，共30例，TET1在两组间的表达差异有统计学意义，x2=3.218，P=0.040。
　　3、根据淋巴结转移个数，将62例患者分为无淋巴结转移组，共29例;有淋巴结转移组，共33例。TET1在两组间的表达差异有统计学意义，x2=5.120，P=0.024。
　　4、根据病理学分期，将62例患者分为0～Ⅰ期组，共19例;Ⅱ期组，共23例;Ⅲ期组，共20例。三组间TET1的表达差异有统计学意义，x2=11.480，P=0.003。采用Spearman进行相关性分析后发现，TET1的表达水平与病理学分期成负相关，相关系数r=-0343，P=0.006。
　　5、根据组织学分级，将62例患者分为Ⅱ级组，共36例;Ⅲ级组，共20例;不能判定者6例。两组间TET1的表达差异有统计学意义，x2=4.134，P=0.042。
　　6、根据术后病理中的脉管瘤栓情况，将62例患者分为有脉管瘤栓组，共35例;无脉管瘤栓组，共26例;无法判定者1例。两组间TET1的表达差异有统计学意义，x2=9.932，P=0.002。
　　7、TET1在不同分子分型乳腺癌中的表达无明显差异，TET1的表达与患者年龄及Ki-67、HER-2、ER、PR、P53的表达无关（P＞0.05）。
　　8、RT-PCR测定HEK-293、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453、hmsc六种细胞的TET1 mRNA的相对表达量分别为0.399±0.007,0.073±0.005,0.103±0.002,0.088±0.003,0.111±0.003,0.025±0.001; qPCR测定以上六种细胞中TET1 mRNA的相对表达量分别为1.070±0.250，0.260±0.150，0.160±0.100，0.060±0.020，0.190±0.220,0.080±0.050，HEK-293细胞系中的TET1 mRNA表达量与其余细胞进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　Western blot法测定六种细胞中TET1蛋白的相对表达量分别为1.252±0.016，0.773±0.008，0.789±0.029，0.860±0.061，0.672±0.002,1.711±0.093。将HEK-293及hmsc细胞中的TET1蛋白表达量与其余细胞进行比较，差异有统计学意义(P＜0.05)
　　9、成功建立高表达TET1的MCF-7细胞模型，收集MCF-7、MCF-7-vector应用流式细胞学技术检测荧光细胞数及荧光强度，两者的荧光细胞数(％)分别为:3.067±0.006和97.557±0.090;荧光强度分别为:11.873±0.111和3320.353±41.787，MCF-7-vector细胞荧光细胞数及荧光强度显著增加，有统计学意义(P＜0.05)。CYBRGreen法qPCR检测TET1mRNA表达，结果显示，与空白对照组MCF-7相比，MCF-7-TET1细胞中TET1上调203.75±25.67倍;与阴性对照组MCF-7-vector相比，MCF-7-TET1细胞中TET1上调70.09±38.47倍，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　10、CCK-8法检测细胞增殖能力，空白对照（MCF-7）及阴性对照组(MCF-7-vector)细胞增殖未见明显差异(P＞0.05)，而MCF-7-TET1细胞增殖能力明显减低，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　11、流式细胞学技术检测细胞周期结果显示，在培养72h后，空白对照及阴性对照组各细胞周期间无显著差异(P＞0.05)，而与两组对照组细胞相比，MCF-7-TET1组细胞虽sub-G0期未见明显变化，但G0/G1期比例明显增加:空白对照及阴性对照组细胞G0/G1期分别占45.57±2.23％、45.29±0.71％，而MCF-7-TET1细胞G0/G1期占57.96±0.74％;同时伴有S期及G2/M期比例明显减低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　12、细胞划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力，与空白对照(MCF-7)及阴性对照组(MCF-7-vector)相比，MCF-7-TET1细胞迁移能力显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　13、qPCR检测各组细胞中EMT相关基因的表达，其中CDH1及CTNNB1表达增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，而VIM及TGFB1表达无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、TET1在原发性乳腺癌组织中的表达较良性乳腺病变组织明显降低;TET1低表达于肿瘤＞2cm、伴有淋巴结转移、病理学分期较晚、高组织学分级及有脉管瘤栓有关，可协助判断病情。
　　2、相较于非肿瘤源性上皮细胞，TET1在乳腺癌细胞中表达明显降低。
　　3、成功构建稳定表达TET1的MCF-7-TET1细胞株及相应对照细胞株MCF-7-vector。
　　4、TET1通过诱导细胞周期G0/G1期阻滞抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖。
　　5、TET1抑制MCF-7细胞迁移，其机制可能与通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT的发生相关。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

参考文献

第一部分 TET1在人乳腺癌组织中的表达与临床病理特点的关系

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 TET1在不同细胞系中的表达及其对MCF-7细胞株生物学行为的影响及相关机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 TET家族及DNA甲基化在肿瘤中作用机制的研究进展

致谢

个人简历