咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌影响的研究

摘要

目的:
　　本研究拟通过建立咬合垂直距离升高的动物模型，研究咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌的影响，初步探讨咬合垂直距离升高对咬肌影响的分子信号机制，为研究正畸临床对不同年龄患者进行咬合垂直距离升高后肌肉的变化和矫治远期的稳定性提供相关的理论依据。
　　方法:
　　第一部分 咬合垂直距离升高动物模型的建立
　　1.实验动物及分组
　　48只雄性Wistar大鼠按照月龄分为两组，实验组大鼠上颌佩戴咬合板升高咬合，对照组仅进行操作对照。
　　2.咬合垂直距离升高的方法。
　　3.操作对照的方法。
　　4.咬合升高动物模型建立的评价。
　　第二部分 咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌组织形态结构的影响
　　1.实验动物分组及动物模型建立同第一部分
　　2.标本留取。
　　3.组织化学分析。
　　4.透射电镜观察。
　　第三部分 咬合垂直距离升高对大鼠咬肌MH-C亚型 mRNA表达的影响及MHC亚型转变的机制探讨
　　1.实验动物分组及动物模型建立同第一部分
　　2.标本留取。
　　3.将所取标本应用real-time PCR技术对咬肌MHC亚型mRNA与生肌调节因子MyoD、myogenin mRNA水平进行相对定量检测。主要步骤包括组织匀浆、Trizol法提取总RNA、RNA完整性检测、引物设计合成、反转录合成cDNA第一链、PCR扩增、ΔΔCT法检测咬合垂直距离升高对MHC亚型mRNA及生肌调节因子MyoD、myogenin mRNA水平的影响，并对重链肌球蛋白的mRNA及myogenin:MyoD mRNA水平做相关性分析。
　　结果:
　　第一部分 咬合垂直距离升高动物模型的建立
　　1.动物的一般情况观察
　　1.1.咬合板存留情况观察
　　不同年龄大鼠咬合板在实验期间均有良好的固位，无咬合板脱落的情况发生。
　　1.2.动物的行为学观察
　　不同年龄组的大鼠在佩戴咬合板后初期的不适反应经过一周后逐渐改善，至观察期末咬合升高组行为学反应与对照组基本一致。
　　1.3.体重变化
　　青少年实验组和年轻成年实验组分别与对照组相比体重无明显统计学差异，P＞0.05。说明咬合升高未明显影响大鼠营养的摄入和体重增长。
　　2.牙(牙合)变化
　　口外观，后牙被动咬合时青少年大鼠及年轻成年大鼠的上切牙均覆盖下切牙唇面约2mm。在咬合升高后14天的观察期内，青少年大鼠较年轻成年大鼠更快的恢复至咬合升高前前牙咬合状态。
　　口内观可见两组不同年龄大鼠咬殆板在实验期间均有良好的固位和口腔卫生状况。随时间的增加，咬合板(牙合)面未见明显不均匀磨耗现象。
　　3.头颅侧位片的观察
　　咬合垂直距离升高后，在观察期内不同年龄大鼠的实验组的咬合垂直距离均大于对照组的VT值，具有统计学意义(P＜0.05);实验组及对照组VT间距的差值在不同年龄组间及在同一年龄组内随时间变化无明显差别（P＞0.05）。说明实验动物的咬合升高成功，且两组的咬合升高程度较一致，观察期内随时间变化一致，模型可以用作后续实验研究。
　　4.HE染色观察
　　青少年大鼠及年轻成年组大鼠对照组及实验组咬肌纤维的形态、排列、细胞核的形态以及组织间质均未见异常，不同年龄组间无明显差异。
　　第二部分 咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌组织形态结构的影响
　　1.组织化学分析结果
　　ATPase染色证明深层咬肌的肌纤维型仅包括MHCⅡ型纤维NADH-TR染色将MHCⅡ型纤维进一步分为三种亚型:深蓝紫色的MHCⅡ a型，浅蓝紫色的MHCⅡb型及介于二者之间的MHCⅡx型纤维。
　　年轻成年组大鼠的深层咬肌也主要由MHCⅡ b型纤维构成，其次为MHCⅡx及MHCⅡa。随观察时间的延长，对照组MHCⅡ各型纤维之间的比例变化不明显。当对年轻成年组大鼠给予咬合升高刺激时，咬合升高7天时，对照组与实验组的MHCⅡ a及MHCⅡ b纤维比例的变化无统计学意义，当咬合升高14天时，MHCⅡa的纤维才开始上升，MHCⅡb的纤维比例随之下降。
　　2.透射电镜观察结果
　　咬合垂直距离升高对咬肌肌丝排列及线粒体结构均产生影响。青少年大鼠较年轻成年组大鼠在咬合升高后肌丝改建速度以及线粒体代偿性数目增多、体积增大的现象出现的更早，而其他细胞器也较少出现的损伤性反应。
　　第三部分 咬合垂直距离升高对大鼠咬肌MHC亚型mRNA表达的影响及MHC亚型转变的机制探讨
　　1.咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠咬肌MHC亚型mRNA表达的影响
　　1.1.年龄对重链肌球蛋白mRNA相对表达量的影响
　　青少年对照组的MHCⅡa mRNA表达量高于年轻成年对照组，而MHCⅡ bmRNA表达量低于年轻对照组，MHCⅡ xmRNA在两组间无统计学差异。
　　1.2.咬合垂直距离升高对重链肌球蛋白mRNA相对表达量的影响
　　咬合升高使青少年大鼠及年轻成年组大鼠的MHCⅡ amRNA相对表达量增加，MHCⅡ b mRNA及MHCⅡ xmRNA相对表达量降低;而年轻成年实验组大鼠MHCⅡ a mRNA及MHCⅡ bmRNA变化的时间较晚。
　　青少年实验组较年轻成年实验组有更高的MHCⅡ a mRNA水平，且MHCⅡbmRNA相对表达量较低。
　　1.3.时间变化对重链肌球蛋白mRNA相对表达量的影响
　　青少年对照组大鼠的MHCⅡ amRNA相对表达量随观察时间的延长有逐渐减小的趋势，MHCⅡbmRNA及MHCⅡxmRNA含量逐渐增加。而年轻成年对照组大鼠的MHCⅡ amRNA、MHCⅡ b mRNA及MHCⅡ xmRNA相对表达量随观察时间的延长无明显变化。
　　青少年实验组大鼠的MHCⅡ amRNA相对含量随观察时间的延长有逐渐减小的趋势，MHCⅡ bmRNA含量有增加趋势;年轻成年实验组大鼠的MHCⅡ amRNA相对含量随观察时间的延长增加，MHCⅡ bmRNA含量随观察时间的延长降低，晚于青少年实验组大鼠向慢收缩MHC异构型mRNA转化的时间。
　　2.咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠咬肌MyoD、myogenin mRNA相对表达量的影响
　　2.1.年龄对MyoD、myogenin mRNA相对表达量的影响
　　实验观察期内，青少年大鼠对照组及实验组的MyoD、myogenin mRNA相对表达量均高于年轻成年大鼠的MyoD、myogenin mRNA相对表达量（P＜0.05）。
　　2.2.咬合垂直距离升高对MyoD、myogenin mRNA相对表达量的影响
　　当对青少年实验组大鼠及年轻成年实验组大鼠分别进行咬合升高时，两组MyoD、myogenin mRNA的表达量都有所增加。
　　2.3.时间对MyoD、myogenin mRNA相对表达量的影响
　　除年轻成年组大鼠对照组的myogenin mRNA在14天观察期内无明显变化外，青少年大鼠实验组及对照组以及年轻成年组大鼠实验组的MyoD、myogenin mRNA相对表达量随时间增加相对含量降低(P＜0.05)。
　　3.咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠myogenin:MyoD mRNA比值的影响
　　3.1.年龄对myogenin:MyoD mRNA比值的影响
　　实验观察期间青少年对照组及实验组的myogenin:MyoD mRNA比值均高于年轻成年对照组及实验组。
　　3.2.咬合垂直距离升高对myogenin:MyoD mRNA比值的影响
　　咬合垂直距离升高使不同年龄组大鼠咬肌的myogenin:MyoD mRNA比值上升，年轻成年组上述比值升高晚于青少年组。
　　3.3.时间对myogenin:MyoD mRNA比值的影响
　　随观察时间的延长，青少年对照组myogenin:MyoD mRNA比值有所下降，而年轻成年实验组的myogenin:MyoD mRNA比值有所增高。
　　4.myogenin:MyoD mRNA比值与重链肌球蛋白各亚型mRNA表达水平的相关性分析
　　咬合垂直距离升高可使青少年及年轻成年大鼠深层咬肌的MyoD及myogenin mRNA水平都有所增加，而myogenin mRNA较MyoD mRNA升高的更多。myogenin:MyoD mRNA这一比值与MHCⅡ a mRNA存在正相关关系，r=0.954;与MHCⅡb mRNA之间存在负相关关系，r=-0.755。
　　结论:
　　1.通过双侧磨牙(牙合)面直接堆塑树脂建立咬合垂直距离升高动物模型具有良好的可操作性及稳定性。
　　2.咬合垂直距离升高可使青少年大鼠及年轻成年大鼠的深层咬肌的组织形态结构、重链肌球蛋白mRNA均向较慢收缩类型发生适应性转化。
　　3.咬合垂直距离升高使青少年大鼠的深层咬肌发生肌纤维由快收缩型向慢收缩型转化的时间较年轻成年大鼠更早、程度更高，提示在正畸临床中于青少年时期进行深覆(牙合)的矫治其咬合垂直距离更稳定。同时也说明对年轻成年患者进行咬合升高治疗需足够的时间并在治疗后需要进行长期的保持。
　　4.生肌调节因子MyoD和myogenin在纤维类型转变中发挥着一定的作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 咬合升高动物模型的建立

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌组织形态结构的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 咬合垂直距离升高对大鼠咬肌MHC亚型mRNA表达的影响及MHC亚型转变机制的探讨

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 咬合垂直距离增加与咬肌关系的研究进展

综述二 生肌调节因子MyoD、myogenin的研究进展

致谢

个人简历