CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响及机制研究

摘要

当今药物滥用在世界范围内已成为一种严重的社会公共卫生问题，给社会造成极大的危害。探究药物依赖的机制，开发有效的戒毒药物是法医工作者重要的研究内容之一。
　　本研究的首要内容是建立一种CCK1或CCK2受体单独稳定表达的细胞实验模型，明确CCK受体的不同亚型对吗啡急慢性作用是否具有不同的调控作用;并进一步考察CCK受体两种不同亚型调节吗啡急慢性作用的细胞分子学机制，为CCK-8在吗啡依赖和复吸防治方面的实际应用提供系统、可靠的理论依据。
　　本文主要分三部分展开研究：
　　第一部分 吗啡受体、CCK1和CCK2受体稳转细胞系的建立
　　目的:构建稳定转染人源μ阿片受体的HEK293-OPRM1细胞系，共同稳定表达人源μ阿片受体和CCK1受体的HEK293-CCK1R细胞系，共同稳定表达人源μ阿片受体和CCK2受体的HEK293-CCK2R细胞系，为进一步研究CCK受体不同亚型对急慢性吗啡作用的影响及机制提供有力的工具。
　　方法:①首先设计含有内切酶NotⅠ的OPRM1-His tag引物对，含内切酶XbaⅠ的His tag-IRES-DsRed monomer引物对，含内切酶EcoRI的CCK1R-V5 tag的引物对，含内切酶XhoⅠ的V5 tag-IRES-EGFP引物对，含内切酶EcoRI的CCK2R-Flag tag引物对，含内切酶XhoⅠ的Flag tag-IRES-EGFP引物对，以不同质粒扩增基因片段，电泳纯化，再以DNA片段OPRM1-His tag和His tag-IRES-DsRed monomer为模板扩增目的基因片段OPRM1-Histag-IRES-DsRed monomer，以DNA片段CCK1R-V5tag和V5 tag-IRES-EGFP为模板扩增目的基因片段CCK1R-V5 tag-IRES-EGFP，以DNA片段CCK2R-Flag tag和Flag tag-IRES-EGFP为模板扩增目的基因片段CCK2R-flag tag-IRES-EGFP，电泳纯化，双酶切目的基因片段连入目的载体质粒，转化细菌挑克隆测序验证;②OPRM1质粒转染HEK-293细胞及筛选稳定系，PCR检测细胞中OPRM1基因的表达;③将CCK1R、CCK2R质粒分别导入细胞OPRM1-HEK293混合稳定系细胞中，PCR检测细胞中CCK1R、CCK2R的表达。
　　结果:①构建载体质粒测序结果与NCBI比对，结果与人源MOR受体，CCK1R，CCK2R mRNA序列完全一致;②100μg/ml潮霉素筛选扩增HEK293-OPRM1细胞，荧光显微镜下可见红色荧光，OPRM1基因的表达量是对照组细胞的8287.65倍，说明混合稳转株构建成功;③300μg/ml博来霉素筛选稳定表达的HEK293-CCK1R细胞，荧光显微镜下见绿色荧光，PCR结果表明CCK1R基因表达为对照组细胞的32993.35倍;④300μg/ml博来霉素筛选稳定表达的HEK293-CCK2R细胞，荧光显微镜下可见绿色荧光，PCR结果表明CCK2R基因表达为对照组细胞的970倍;⑤稳转细胞培养十代后，MOR，CCK1R，CCK2R基因仍然高表达。
　　结论:本部分成功构建了P3.1-hygro-OPRM1-Histag-2，P3.1-Zeo-CCK1R-V5 tag-1和P3.1-Zeo-CCK2R-flag-1的表达载体，并建立了稳定表达OPRM1的HEK293-OPRM1细胞系;首次建立了共同表达OPRM1和CCK1R的HEK293-CCK1R细胞系，共同表达OPRM1和CCK2R的HEK293-CCK2R细胞系。为下面进一步研究CCK不同受体亚型对MOR受体功能影响奠定了基础。
　　第二部分 CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响
　　目的:通过测定急慢性吗啡作用后细胞内cAMP含量的变化，观察CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响，并分别敲减了HEK293-OPRM1细胞的两种CCK受体，观察其对吗啡急慢性作用的影响，以进一步说明两受体对吗啡急慢性作用的影响。
　　方法:①用时间分辨荧光共振能量转移的方法(TR-FRET)测定10μM吗啡与5μM forskolin共同孵育15min、10μM吗啡预处理6h，12h，16h，24h、100μM纳洛酮催促15min后HEK-293细胞，HEK293-OPRM1细胞，HEK293-CCK1R细胞和HEK293-CCK2R细胞内cAMP含量，与对应非吗啡处理组比较;②用小干扰RNA分别敲减HEK293-OPRM1细胞内CCK1R和CCK2R，用TR-FRET法测定10μM吗啡与5μM forskolin作用15min、10μM吗啡预处理4h后细胞内cAMP含量，与转染阴性对照组比较。
　　结论:①证实了CCK1受体可减弱急性吗啡对cAMP的抑制作用，阻碍慢性吗啡作用纳洛酮催促戒断引起的cAMP超射，阻断了吗啡依赖戒断的形成;②CCK2受体虽然也能减弱急性吗啡对cAMP的抑制作用，但却可易化慢性吗啡作用纳洛酮催促戒断引起的cAMP超射，促进吗啡依赖和戒断反应，并具有时间依赖性，说明在慢性吗啡作用中两种受体发挥着不同的作用。
　　第三部分 CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响机制
　　目的:本部分通过Western Blot的方法监测吗啡作用于稳转细胞系后CREB、ERK1/2的活化及μ阿片受体(MOR)磷酸化变化情况，明确不同CCK受体亚型对吗啡急慢性作用的影响机制。
　　方法:用Western Blot的方法检测吗啡急性、慢性作用HEK-293细胞、HEK293-OPRM1细胞、HEK293-CCK1R细胞和HEK293-CCK2R细胞所引起的p-CREB、CREB、p-ERK1/2、ERK1/2、p-MOR含量变化。
　　结果:①急性吗啡作用(15min)，显著抑制了HEK293-OPRM1细胞的p-CREB水平，过表达CCK1和CCK2受体显著减弱了此抑制作用，CCK1受体作用更强;急性吗啡作用显著增加了HEK293-OPRM1细胞的p-ERK1/2水平，过表达CCK1受体拮抗了此作用，过表达CCK2受体对此没有影响;急性吗啡作用显著增加HEK293-OPRM1细胞的p-MOR水平，过表达CCK1和CCK2受体均减弱了影响，CCK1受体作用更显著;②慢性吗啡作用6h，HEK293-OPRM1细胞的p-CREB水平未见变化，仅见p-ERK1/2水平增加;而过表达CCK2受体，p-CREB和p-ERK1/2水平均显著增加;过表达CCK1受体，p-CREB未见变化，p-ERK1/2水平减低;③慢性吗啡作用12h，显著增加了HEK293-OPRM1细胞的p-CREB水平，p-ERK1/2未见变化，而总的ERK1/2下降，提示ERK1/2的活性增加;过表达CCK1受体，降低了p-CREB水平，上调CREB和ERK1/2，降低CREB和ERK1/2的活性;过表达CCK2受体虽未影响p-CREB水平，减弱了CREB下调， CREB的活性降低，但对ERK1/2的活性没有影响。
　　结论:①CCK受体显著减弱急性吗啡对CREB活化的抑制作用，CCK1受体作用更强;CCK1受体抑制了慢性吗啡引起CREB活性上调;CCK2受体可促进慢性吗啡对CREB活性上调，但随着时间的延长，作用逐渐减弱，呈时间依赖性;②CCK1受体拮抗了急慢性吗啡引起的ERK1/2活性的增强，CCK2受体不影响急性吗啡对ERK活性的调节作用，而促进了慢性吗啡对ERK1/2活性调节;③CCK1，CCK2受体显著减弱急性吗啡引起的p-MOR，其中CCK1受体作用更强。
　　结论:1 成功构建了稳定表达MOR的HEK293-OPRM1细胞系;首次构建了稳定共表达MOR和CCK1受体的HEK293-CCK1R细胞系，及稳定共表达MOR和CCK2受体的HEK293-CCK2R细胞系。
　　2 首次直接证实CCK1受体可抑制吗啡急慢性作用;CCK2受体可抑制吗啡的急性作用，但易化了吗啡依赖的形成，并具有时间依赖性，说明在慢性吗啡作用中两种受体发挥着不同的作用。
　　3 CCK1受体通过抑制急性吗啡对CREB和ERK1/2的调节抑制了吗啡急性作用;CCK2受体仅抑制急性吗啡对CREB的调节，对吗啡急性作用抑制较弱。CCK1受体通过阻断慢性吗啡上调CREB和ERK1/2阻断了吗啡慢性作用;CCK2受体通过易化吗啡慢性作用对CREB和ERK1/2的上调，易化了吗啡慢性作用。
　　4 过表达CCK受体可抑制急性吗啡引起的MOR磷酸化，以CCK1受体作用最为显著。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 吗啡受体、CCK1和CCK2受体稳转细胞系的建立

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用影响的信号机制研究

前言

材科与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 μ阿片受体调节机制研究进展

致谢

个人简历