缺血后处理对大鼠肝脏缺血再灌注胆管细胞凋亡的影响

摘要

目的：通过建立大鼠肝脏缺血再灌注模型，观察缺血后处理(ischemicpostconditioning,IPO)在肝脏缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion,IR)中对胆管细胞的保护作用。探讨缺血后处理抑制胆管细胞凋亡的机制，为临床中肝脏缺血再灌注时减轻胆道的损伤提供更加有效的措施及理论机制。
　　方法：
　　1、模型制备：24只清洁级健康雄性SD大鼠，体重200g-300g，随机分为3组:假手术组(sham–operation，SO组)、缺血再灌注组(ischemiareperfusion，IR组)、缺血后处理组(ischemicpostconditioning，IPO组),每组8只。各组SD大鼠适应性喂养l周，术前12小时内禁食，自由进水。均采取0.3％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠平卧位固定于手术台，备皮消毒。所有手术操作均在无菌条件下进行。1）.假手术组（SO组）：大鼠麻醉后，常规备皮、消毒，铺无菌巾，于上腹部正中取一长约3-4厘米（能使肝脏充分显露即可）纵行切口，将腹壁各层依次切开，肝脏显露后进一步游离出肝十二指肠韧带关腹，无其他干预。目的是作为正常对照组以排除手术因素对实验结果的干扰。2）.缺血再灌注组（IR组）：在SO组基础上，游离肝十二指肠韧带后，模拟Pringle法，用无损伤动脉夹将肝门区域夹闭，造成肝脏缺血，缺血30min后取下血管夹，使血管开放，对肝脏行持续再灌注，最后关腹。3）.缺血后处理组（IPO组）：在IR组基础上，血供完全恢复之前再灌注10秒，夹闭10秒，如此反复行6个循环（共2分钟）后完全恢复血供。
　　2、各组大鼠于术后4小时候进行标本采集，采血器经心脏采血后，常温下静置30min，然后放入离心机3000r/min，离心15min，离心完成后提取血清标本，存放于-80℃冰箱保存，待检测超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）活力、r-谷氨酰胺转酞酶（Glutamyltranspeptidase，r-GT）活性。同时于肝门部位取肝组织标本，置于10%中性福尔马林溶液固定24小时后，石蜡包埋，备检。
　　3、应用比色法检测血清SOD及r-GT水平。
　　4、用HE染色法观察、比较胆管细胞的形态变化；
　　5、应用免疫组化法检测胆管细胞Bcl-2及Bax的表达水平；
　　6、脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatedd-UTPnickendlabeling,TUNEL)检测胆管细胞凋亡，并计算细胞凋亡指数(apoptosisindex,AI)。
　　7、实验数据采用spss13.0软件进行处理，结果用均数±标准差（x±s）表示，多组数据比较采用方差分析SNK法，P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　结果：
　　(1)HE染色结果显示：SO组肝组织中肝细胞条理整齐，肝小叶的结构未见损坏，汇管区正常，胆管的结构无异常，偶可见少量中性粒细胞的浸润。IR组则可见部分肝小叶无清晰的结构显现，在中央静脉的周围可见坏死的大片的肝细胞，汇管区肝内胆管可见上皮细胞的损伤，并伴有大量的炎性细胞的浸润，细胞凋亡较多。IPO组病理改变较IR组明显减轻，肝小叶结构相对完整，肝细胞变性的程度减轻，汇管区炎性浸润较轻，胆管上皮连续完整，炎细胞浸润少。
　　(2)反应胆管上皮细胞损伤的标志物r-GT在假手术组活力值最低，IR组最高，IPO组活力值较SO组升高，但较IR组减低，且差异均有统计学意义（P<0.05）。
　　(3)血清中SOD的表达水平显示SOD的活力值在各组之间无统计学意义(P>0.05)。
　　(4)抗细胞凋亡蛋白Bcl-2的表达：SO组胆管组织中Bcl-2阳性表达率低于IR组及IPO组，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。IR组胆管Bcl-2阳性表达率低于IPO组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　(5)促细胞凋亡蛋白Bax的表达：IR组及IPO组Bax阳性表达率高于SO组，IPO组的阳性表达率低于IR组，且差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　(6)胆管组织细胞凋亡水平：SO组胆管组织中仅可见有少量凋亡细胞表达，凋亡指数为26.06±2.27，而在IR组中凋亡细胞数量增强，凋亡指数为79.31±1.12，两者AI比较其差异具有统计学意义(P<0.05)，IPO组凋亡指数为58.90±2.75，且IPO组和IR组相比较凋亡细胞减少，AI下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，但未降至SO组水平，二者AI比较差异亦具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　1．肝脏缺血再灌注可以导致胆管上皮细胞凋亡，从而引发胆管损伤。
　　2．缺血后处理可以减轻肝脏缺血再灌注损伤中肝脏及胆管组织损伤。
　　3．在不影响胆管组织血流的情况下，不会引起Bcl-2蛋白及Bax蛋白的变化。
　　4．缺血后处理对胆管上皮细胞的保护作用可能通过促进Bcl-2蛋白表达及抑制Bax蛋白的表达，而拮抗胆管细胞凋亡的发生。

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前言

材料与方法

1 实验动物及分组

2 主要仪器设备及产地

3主要试剂及药品

4 模型的制备

5 取材

6 实验方法

7 统计方法

结果

1．手术过程中大体标本的观察

2．血清 r-谷氨酰转肽酶活力：

3．血清超氧化物歧化酶活力

4. HE染色结果显示

5.免疫组化检测Bcl-2蛋白显示

6.免疫组化检测Bax蛋白显示：

7.胆管组织细胞凋亡水平：

附图

附表

讨论

1缺血后处理

2 胆管细胞

3缺血后处理调控Bcl-2蛋白家族抑制胆管细胞凋亡

4 总结

结论

参考文献

综述:不同处理方式在肝脏缺血再灌注中抑制细胞凋亡的机制

致谢

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