16个氨基酸多肽片段对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的保护作用及机制研究

摘要

目的：
　　酒精、慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、肥胖、自身免疫性肝炎、代谢性疾病、药物毒物和胆汁淤积等均可导致肝纤维化，几乎所有的慢性肝病都与纤维化相关，而且易进展为肝硬化、肝衰竭、肝癌。进展性的肝纤维化尚且可逆转，肝硬化则基本不可逆。四氯化碳（Carbon tetrachloride， CCl4）诱导的小鼠慢性肝损伤模型已较成熟，可用来模拟人类众多慢性肝脏疾病的共同病理过程—肝纤维化。经 CCl4长期刺激可致小鼠肝细胞坏死、炎症、纤维组织增生，伴随血清天冬氨酸转氨酶（ aspartate aminotransferase, AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransaminase, ALT）升高，并且有大量炎性细胞浸润，细胞外基质大量胶原沉积。
　　为寻找早期肝炎临床诊断的生物标志物，本室前期运用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）从慢性肝炎病人血清中检测到一个差异性表达的多肽，即16个氨基酸多肽片段，并通过体外实验证实该多肽有促进肝细胞增殖的作用。
　　本室前期研究成果已证实该多肽针对免疫性肝炎肝损伤及脂肪肝具有保护作用，推测其可能在慢性肝脏疾病中发挥同样的保护作用，故进行本研究。本研究利用四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型研究16个氨基酸多肽片段在肝纤维化中的治疗作用，并对其机制初步探究，为进一步临床肝病治疗提供实验依据。
　　方法：
　　116个氨基酸多肽片段对肝纤维化小鼠的保护作用
　　50只雄性，6-8周龄balb/c小鼠随机分为五组，分别为正常组，模型组，秋水仙碱组，16个氨基酸多肽低剂量组（400μg/kg），高剂量组（800μg/kg），每组10只。除正常组在相应给药时点腹腔注射生理盐水（1ml/kg）外，其余各组均分别通过腹腔注射给予25％CCl4溶液（1.5μl/g），每3天1次，共10次。同时，在第三次注射CCl4之后，除正常组、模型组分别在相应给药时点通过尾静脉注射给予生理盐水外，其余各组分别经尾静脉注射给予400、800μg/kg体重多肽，每3天1次，持续7次或经灌胃给予秋水仙碱（200μg/kg），每周五天，持续3周后，眼球取血，收集小鼠血液，分离血清，采用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）水平；ELISA试剂盒测定血清透明质酸酶（Hyaluronic Acid，HA）、四型胶原（Collagen TypeⅣ，Ⅳ-C）水平。通过血清学指标观察16个氨基酸多肽片段对CCl4诱导肝纤维化的影响。
　　2肝组织病理学检测
　　眼球取血后处死小鼠，剥离肝脏，分别切取肝脏左叶、右叶相同位置合适大小的两块肝组织（一般厚度不超过0.5厘米）制成组织蜡块，行5μm连续切片后分别进行 HE染色、Masson染色，于光学显微镜下观察肝组织病理学形态及胶原沉积情况，并采集图像。
　　3小鼠肝纤维化相关基因表达水平的测定
　　自NCBI中获取小鼠源Ⅰ型胶原（Collagen, typeⅠ, alpha1,Col1a1）、Ⅲ型胶原（ Collagen, typeⅢ, alpha1,Col3a1）、金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase, TIMP-1）、基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMP-2）、结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor, CTGF）的基因序列,设计并合成引物（上海生工生物工程有限公司）。提取小鼠肝组织总RNA，反转录合成 cDNA，分别以10倍稀释的Col1a1、Col3a1、TIMP-1、MMP-2、CTGF、GAPDH cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。反应结束后确认扩增曲线和融解曲线，记录基因相对表达量RQ值进一步分析。探讨16个氨基酸多肽片段对CCl4诱导的肝纤维化的相关作用机制。
　　4肝细胞内活性氧的测定
　　采用流式细胞术，对各组肝细胞内活性氧（Reactive oxygen species, ROS）含量进行检测，了解氧化应激水平。
　　结果：
　　1各组小鼠血清肝功能及肝纤维化变化情况
　　16个氨基酸多肽片段低剂量组（36.85±3.36，71.03±7.42）、高剂量组（35.27±4.34，73.03±8.13）、秋水仙碱组（34.65±5.57，69.49±11.76）及正常组（31.05±2.91，62.02±9.46）血清 ALT、AST水平均低于模型组（45.07±5.32，85.48±3.44）（P＜0.05）；各组血清ALP水平均无差异（P＞0.05）；模型组（286.95±37.82）血清HA水平较正常组（229.15±32.43）升高（P＜0.05），其他各组较模型组有所降低，但并无差异；16个氨基酸多肽片段低剂量组、高剂量组及正常组血清Ⅳ-C水平（129.68±29.87，109.26±30.16，79.10±30.33）均低于模型组（180.96±40.73）（P＜0.05），秋水仙碱组（157.12±32.26）较模型组有所降低，但并无差异（P＞0.05），16个氨基酸多肽片段低剂量组、高剂量组血清Ⅳ-C水平均低于秋水仙碱组（P＜0.05）。
　　2肝组织病理学检测结果
　　HE结果显示，模型组小鼠肝细胞杂乱无章，中央静脉和门管区有纤维组织生成，并伴有大量炎细胞浸润，出现大片肝细胞坏死区域；秋水仙碱阳性对照组有效改善肝细胞坏死情况，炎细胞浸润减少；16个氨基酸多肽片段两个剂量组均未见明显坏死及炎细胞浸润。
　　Masson染色模型组中央静脉、汇管区可见大量绿色胶原纤维，肝小叶被宽窄不一的纤维间隔分割成假小叶；秋水仙碱阳性对照组肝纤维化程度降低，仅见少量纤维组织；16个氨基酸多肽片段两个剂量组与模型组相比纤维组织显著减少。
　　3各组小鼠肝纤维化相关基因表达水平变化
　　荧光定量PCR结果显示，16个氨基酸多肽片段低剂量组（7.18±1.61，3.44±1.73，4.37±1.56，3.39±3.19，1.45±0.77）、高剂量组（5.66±2.07，3.77±2.64，3.43±1.42，3.43±2.92，1.68±1.21）、秋水仙碱组（9.60±0.52，5.58±0.65，3.97±4.01，5.93±4.84，1.91±1.03）及正常组（1.00）肝组织 Col1a1、Col3a1、TIMP-1、MMP-2、CTGF各基因表达水平均低于模型组（20.67±6.60，12.61±1.35，8.25±1.77，11.93±6.82，3.97±1.90）（P＜0.05）。
　　4各组小鼠肝细胞内活性氧（ROS）水平变化情况
　　16个氨基酸多肽片段低剂量组（431.83±174.80）、高剂量组（404.50±199.43）、秋水仙碱组（523.00±218.61）及正常组（220.33±62.69）ROS水平均低于模型组（859.63±337.81）（P＜0.05）。
　　结论：
　　116个氨基酸多肽片段可显著改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化。
　　216个氨基酸多肽片段减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化损伤其机制可能与减少氧化应激反应，抑制TIMP-1、MMP-2、CTGF因子的表达有关。

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 血清ALT、AST、ALP浓度的测定

4 血清HA、Ⅳ-C含量的测定

5 肝组织病理学检测

6 荧光定量PCR检测小鼠肝组织Col1a1、Col3a1、TIMP-1、MMP-2、CTGF基因的表达

7 肝细胞悬液制备及活性氧测定

8 统计学处理

结果

1 16个氨基酸多肽片段对肝纤维化小鼠血清肝功能的影响

2 16个氨基酸多肽片段对肝纤维化小鼠血清HA、Ⅳ-C的影响

3 16个氨基酸多肽片段对肝纤维化小鼠肝脏病理学的影响

4 16个氨基酸多肽片段对肝组织Col1a1、Col3a1、TIMP-1、MMP-2、CTGF基因表达水平的影响

5 16个氨基酸多肽片段对肝纤维化小鼠细胞内活性氧（ROS）的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 细胞因子与肝脏疾病的研究进展

致谢

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