雷公藤内酯醇和美托洛尔对小鼠黑色素瘤B16细胞株的影响

摘要

目的：黑色素瘤恶性程度高，易发生转移且手术切除后复发率高。目前，其发病率在世界范围内不断地增加。现在的医疗手段对其并没有理想的治疗方法。为寻找治疗恶性黑色素瘤的有效药物，本文探讨雷公藤内酯醇和美托洛尔对小鼠黑色素瘤 B16细胞株的影响及部分作用机制，为临床治疗提供基础实验依据。
　　方法：
　　1、细胞培养
　　2、采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制B16细胞的生长曲线，了解B16细胞生长特征，为后续试验做准备。
　　3、采用MTT法检测两种药物在不同时间和不同浓度下对B16细胞的影响。
　　4、应用倒置显微镜和HE染色法观察B16细胞在药物干预前后相关因素的变化。
　　5、应用流式细胞技术(FCM)检测B16细胞周期和凋亡情况。
　　6、采用免疫细胞技术检测血管内皮生长因子表达情况。
　　7、应用统计软件SPSS16.0进行统计学分析。
　　结果：
　　1、MTT法绘制B16细胞生长曲线
　　细胞在96孔板中培养不同时间后，用酶标仪测OD值，绘制成的生长曲线近似“S”型。
　　2、 MTT检测结果
　　随着雷公藤内酯醇浓度的增高、药物作用时间的延长，其对细胞的抑制作用越大（P<0.05）。随着美托洛尔浓度的增高、药物作用时间延长，其对细胞的抑制作用越大（P<0.05）。雷公藤内酯醇组与美托洛尔组比较，两种药物干预细胞24小时后，2.5ng/ml浓度的雷公藤内酯醇组的抑制率与15.63ug/ml浓度的美托洛尔组的抑制率无显著差异（P>0.05）；5.0ng/ml浓度的雷公藤内酯醇组的抑制率与31.25ug/ml浓度的美托洛尔组的抑制率无显著差异（P>0.05），其余不同浓度组间相比有显著差异（P<0.05）。两种药物干预细胞48小时后，2.5ng/ml浓度的雷公藤内酯醇组的抑制率与15.63ug/ml浓度的美托洛尔组的抑制率无显著差异（P>0.05）；5.0ng/ml浓度的雷公藤内酯醇组的抑制率与31.25ug/ml浓度的美托洛尔组的抑制率无显著差异（P>0.05），其余不同浓度组间相比有显著差异（P<0.05）。两种药物干预细胞72小时后，两药物不同浓度组间相比较均有显著差异（P<0.05），且25ng/ml浓度的雷公藤内酯醇组对B16细胞抑制作用最大。
　　3、倒置显微镜下细胞形态特征及培养基颜色观察
　　药物干预前，B16细胞生长良好，呈多角形或菱形，贴壁生长，单层均匀分布，细胞间可见细丝连接，细胞膜完整，可见细胞核，折光性好，培养基澄清透明。药物干预后，细胞贴壁能力下降，部分细胞呈漂浮生长状态，细胞变小、变圆、皱缩，细胞间连接消失，核折光性下降，随着药物浓度的增高及药物作用时间的延长，细胞的形态变化越大,且雷公藤内酯醇组对细胞形态影响强于美托洛尔组。雷公藤内酯醇组培养基的颜色随着药物浓度的变大、作用时间的延长，各浓度组间呈现由暗黄色到粉红色的梯度颜色变化。美托洛尔各浓度组间培养基颜色无明显变化。
　　4、HE染色观察B16细胞形态学特征
　　药物干预前，镜下可见细胞质呈粉红色，细胞核呈蓝色，可见核分裂，多个细胞核，细胞膜完整，细胞贴壁数目较多，细胞间连接紧密，细胞分布均匀。药物干预后，贴壁细胞数目少，细胞间连接消失，可见孤立、成团的细胞，细胞膜部分破裂，可见细胞核萎缩、碎裂。比倒置显微镜下观察细胞形态更清晰。相对于美托洛尔组而言，雷公藤内酯醇对细胞形态影响更大。
　　5、药物对B16细胞的细胞周期及凋亡的影响
　　两药物组分别与对照组比较，G0/G1期随着药物浓度增高，处于该周期的细胞比例增加（P<0.05），S期随着药物浓度的增高，处于该期的细胞比例减少（P<0.05）。两种药物干预细胞48小时后，在B16细胞 DNA直方图上没有发现明显的亚 G1峰（细胞凋亡峰）。
　　6、药物对B16细胞VEGF蛋白表达影响
　　两种药物组分别与对照组比较，VEGF蛋白量表达均下降（P<0.05），且雷公藤内酯醇组随着药物浓度的增加VEGF表达量下降（P<0.05），美托洛尔组随着药物浓度的增加VEGF表达量无明显下降（P>0.05）。雷公藤内酯醇组与美托洛尔组比较，雷公藤内酯醇使 VEGF蛋白表达量的下降更显著。
　　结论：
　　1、雷公藤内酯醇和美托洛尔均可抑制小鼠黑色素瘤B16细胞的增殖，且在一定范围内具有浓度依赖性和时间依赖性。
　　2、雷公藤内酯醇和美托洛尔可将细胞周期抑制在 G0/G1期，且在一定范围内有浓度依赖性。本实验未检测到两种药物引起的凋亡现象，可能是被干预的细胞正处于凋亡的早期阶段等原因，故不能排除两种药物通过凋亡机制抑制B16细胞的可能性，需进一步探讨。
　　3、雷公藤内酯醇和美托洛尔均能使B16细胞中VEGF表达量下降，且雷公藤内酯醇的抑制作用强于美托洛尔并具有浓度依赖性。故可以推断抑制VEGF表达可能是两种药物抗肿瘤的作用机制之一。
　　4、雷公藤内酯醇对B16细胞的抑制增殖作用强于美托洛尔。

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中文摘要

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 MTT法绘制B16细胞生长曲线

2 MTT检测结果

3 倒置显微镜下细胞形态特征及培养基颜色观察

4 HE染色观察B16细胞形态学特征

5 两种药物对B16细胞的细胞周期及凋亡的影响

6 两种药物对小鼠黑色素瘤B16细胞VEGF蛋白表达量的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:晚期恶性黑色素瘤的治疗进展

致谢

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