双氢青蒿素对头颈部鳞癌细胞增殖抑制作用及化疗药物敏感性影响的研究

摘要

目的：研究双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)对喉癌细胞Hep-2及舌癌细胞Cal-27增殖抑制作用的影响，初步研究DHA联合顺铂(Cisplatin,DDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)以及紫杉醇(Paclitaxel,PTX)对Hep-2及Cal-27细胞增殖抑制作用的影响，探究DHA是否可通过作用于Stat3通路影响化疗药物的作用，寻求肿瘤联合化疗的新策略。
　　方法：
　　1、体外培养喉癌细胞Hep-2、舌癌细胞Cal-27,使用不同浓度的DHA（0、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM）分别作用24h、36h、48h,使用MTT法对细胞增殖情况进行检测。
　　2、使用不同浓度的DDP（0、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml）、5-FU（0、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml）、PTX（0、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml）或其与10μM的DHA联合应用，分别作用于Hep-2细胞及Cal-27细胞24h、48h,使用MTT法对细胞增殖情况进行检测。
　　3、使用DDP（1μg/ml）、5-FU（20μg/ml）、PTX（10ng/ml）或其与10μM的DHA联合应用，作用于Hep-2细胞及Cal-27细胞24h、48h后，使用Westernblot法检测蛋白Stat3,p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl的表达情况。
　　结果：
　　1.1不同浓度的DHA对喉癌细胞Hep-2增殖均有抑制作用，使用析因方差分析显示，其抑制作用呈时间（Ft=4.945，P=0.03＜0.05）、剂量（Fc=42.715，P=0.00＜0.01）依赖性。DHA作用于人喉癌细胞Hep-2在24小时、36小时、48小时使用，使用CompuSyn软件计算IC50结果为：105.972μM、61.096μM、58.179μM。
　　1.2不同浓度的DHA处理舌癌Cal-27细胞不同时间，所得结果显示，其抑制作用呈时间（Ft=58.476，P=0.00＜0.01）、剂量（Fc=450.735，P=0.00＜0.01）依赖性。DHA作用于人舌癌细胞Cal-27在24小时、36小时、48小时的IC50结果分别为：103.234μM、61.729μM、52.676μM。
　　2.1DHA与常用化疗药物联合应用对喉癌Hep-2细胞增殖的影响。使用MTT法测细胞生存率，析因方差分析各组间的差异，使用ComPusyn软件绘制24小时及48小时两药物的等效线。（1）DDP作用于Hep-2细胞，对Hep-2细胞的抑制呈时间(Ft=26.141，P=0.00＜0.01)、剂量(Fc=95.983，P=0.00＜0.01)依赖性。10μM的DHA与不同浓度的DDP联合应用作用24小时、48小时均呈协同作用。（2）体外培养Hep-2细胞，不同浓度的5-FU作用24小时、48小时，对于细胞的抑制作用呈时间(Ft=422.750,P=0.00＜0.01)、剂量（Fc=39.988，P=0.00＜0.01）依赖性。等效线法分析显示：在24小时、48小时，不同浓度的5-FU与10μM的DHA联合应用，均呈协同作用。（3）PTX作用于Hep-2细胞，对细胞的抑制呈时间（Ft=245.324,P=0.00<0.01）、剂量（Fc=195.628,P=0.00<0.01）依赖性。等效线法分析结果显示：两药联合作用呈协同作用。
　　2.2DHA与常用化疗药物联合应用对舌癌Cal-27细胞的影响。（1）DDP及DDP联合10μM的DHA对Cal-27细胞均有抑制作用。呈时间（Ft=22.395,P=0.00<0.01）、剂量（Fc=71.572，P=0.00<0.01）依赖性。10μM的DHA与不同浓度的DDP联合应用，在24小时及48小时各浓度均呈协同作用。（2）5-FU及5-FU与DHA联合组作用，对细胞增殖的抑制呈时间（Ft=1893.202，P=0.00<0.01）、剂量依赖性（Fc=1865.411，P=0.00<0.01）。药物处理24小时、48h后，5-FU各浓度与DHA均呈协同作用。（3）PTX对细胞作用呈时间（Ft=478.170,P=0.00<0.01）、剂量依赖性（Fc=547.807,P=0.00<0.01）。等效线图解法结果显示：PTX各浓度与DHA联合作用在24小时及48小时均呈协同作用。
　　3、Westernblot检测DHA与DDP、5-FU、PTX联合应用于Hep-2及Cal-27细胞后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化，使用单因素方差对结果进行分析。其中各组Stat3表达均无差别（P>0.05），对于p-Stat3、Bcl-xl的表达进行分析。（1）DDP与DHA联用组与单药组相比，p-Stat3（P=0.00＜0.01）、Bcl-xl（P=0.00＜0.01）的表达明显减少。DHA可能通过影响Stat3通路影响增加DDP对Hep-2、Cal-27细胞的敏感性。（2）Hep-2及Cal-27细胞在给予DHA联合5-FU处理后与单药组相比，p-Stat3（P=0.00＜0.01）及凋亡相关蛋白Bcl-xl（P=0.00＜0.01）明显减少。可见DHA能够通过影响Stat3通路影响5-FU对两细胞的抑制作用。（3）PTX联合DHA作用于Hep-2细胞及Cal-27细胞。PTX单药组及DHA联合PTX组p-Stat3表达均升高，且联合组增高更明显。DHA与PTX联用对细胞增殖的抑制可能并非通过影响Stat3通路作用。检测其下游凋亡相关蛋白Bcl-xl表达，显示联合组Bcl-xl的表达较单药组降低。
　　结论：
　　1、DHA对喉癌细胞Hep-2、舌癌细胞Cal-27细胞的增殖具有抑制作用。
　　2、体外培养喉癌细胞Hep-2、舌癌Cal-27细胞，DHA能够增强DDP、5-FU、PTX的化疗敏感性。
　　3、DHA对DDP、5-FU、PTX的增敏作用至少部分通过Stat3通路作用，而其对于PTX的增敏作用可能并非通过Stat3通路作用。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

1材料

1.1细胞系：

1.2主要试剂：

1.3主要仪器

1.4溶液配制

2.试验方法

2.1细胞培养

2.2 MTT法检测细胞增殖

2.4 Western blot检测蛋白表达情况

2.5统计学分析

结果

2.1 DHA与常用化疗药物联合应用对喉癌Hep-2细胞的影响

2.1.1 使用MTT法测DDP及DDP与DHA联合用对Hep-2细胞增殖的影响

2.1.2 使用MTT法检测5-FU及5-FU联合DHA对Hep-2细胞增殖的影响

2.1.3使用MTT法测PTX及PTX联合DHA对Hep-2细胞增殖的影响

2.2 DHA与常用化疗药物联合应用对舌癌Cal-27细胞的影响

2.2.1 使用MTT法检测DDP及DDP联合DHA用对Cal-27细胞增殖的影响

2.2.2使用MTT法测5-FU及5-FU联合DHA对Cal-27细胞增殖的影响

2.2.3使用MTT法测PTX及PTX联合DHA对Cal-27细胞增殖的影响

3.1 Western blot检测DHA与DDP、5-FU、PTX联合应用于Hep-2细胞后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

3.1.1 Western blot检测DHA与DDP联合作用于Hep-2后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

3.1.2 Western blot检测DHA与5-FU联合作用于Hep-2后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

3.1.3 Western blot检测DHA与5-FU联合作用于Hep-2后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

3.2 Western blot检测DHA与DDP、5-FU、PTX联合应用于Cal-27细胞后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

3.2.1 Western blot检测DHA与DDP联合作用于Cal-27细胞后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

3.2.2 Western blot检测DHA与5-FU联合作用于Cal-27细胞后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

3.2.3 Western blot检测DHA与PTX联合作用于Cal-27细胞后，Stat3、p-Stat3及凋亡相关蛋白Bcl-xl表达水平的变化

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:双氢青蒿素抗肿瘤作用的相关研究

致谢

个 人 简 历