Caveolin-1调控HER-2活化对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分:Caveolin-1在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性
　　目的:
　　本研究拟应用免疫组化、体外培养细胞、质粒转染、免疫蛋白印迹等实验技术，探讨Caveolin-1参与乳腺癌的作用及其可能机制，从细胞、组织和分子水平综合分析Caveolin-1对HER-2磷酸化的调控，探讨Caveolin-1在Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信号传导通路中的作用，为阐明乳腺癌发病机制提供新的实验数据，为有效预防和治疗乳腺癌提供新的靶点。
　　方法:
　　1.采用非生物素酶二步(PV)免疫组织化学方法，检测50例分化程度不同的浸润性乳腺癌组织及正常乳腺组织中Caveolin-1的表达，探讨其与乳腺癌临床生物学行为的关系及对预后的意义。
　　2.了解Caveolin-1和磷酸化人类表皮生长因子受体2(p-HER-2)的表达情况，以正常乳腺组织或乳腺良性增生为阴性对照。
　　结果:
　　1.免疫组化检测Caveolin-1、HER-2、Ki-67在乳腺癌组织中的表达免疫组化结果显示，Caveolin-1的阳性表达产物主要分布于乳腺上皮细胞的胞浆，呈现黄色-棕褐色颗粒。按判定标准Caveolin-1在正常乳腺组织中阳性表达的程度较强，在浸润性乳腺癌组织中表达较少，其表达率分别为80％和32％，两者比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。Ki-67的阳性表达产物主要分布于乳腺上皮细胞的胞核，HER-2的阳性表达产物主要分布于乳腺上皮细胞的胞膜，呈现黄色-棕褐色颗粒。
　　2.Caveolin-1、HER-2、 Ki-67的表达与乳腺癌临床病理因素的关系免疫组织化学结果显示，Caveolin-1在浸润性乳腺癌中的表达水平随淋巴结的转移而减低(P＜0.05)，随临床TNM分期而减低(P＜0.05)，各组间差异有统计学意义。Caveolin-1在浸润性乳腺癌中的表达水平与患者年龄、肿瘤直径、ER/PR、HER-2、Ki-67、及绝经前后等表达无关。
　　第二部分：Caveolin-1影响乳腺癌细胞生物学行为的的分子机制
　　目的：
　　探讨Caveolin-1影响乳腺癌细胞生物学行为的的分子机制
　　方法:
　　1.细胞复苏和培养
　　将MDA-MB-453细胞冻存管从液氮中取出，融化后用含10％胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml的1640培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
　　2.质粒提取
　　用QIAGEN质粒提取试剂盒，分别提取pcDNA3.1-Cav1和pcDNA3.1阴性对照质粒，构建稳定转染细胞。设置MDA-MB-453组、pcDNA3.1-Cav1（Cav-1）转染组和pcDNA3.1转染对照组，加嘌呤霉素进行抗性筛选，未转染组细胞全部死亡。稳定转染pcDNA3.1-Cav1质粒的MDA-MB-453细胞即MDA-MB-453/Cav-1，稳定转染阴性对照质粒的MDA-MB-453细胞即MDA-MB-453/pcDNA3.1。
　　3.Western blot和实时定量PCR验证过表达Caveolin-1效果
　　培养MDA-MB-453、MDA-MB-453/Cav-1和MDA-MB-453/pcDNA3.1细胞，待细胞长满至培养皿的80％左右，用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养4小时，收集细胞提取总蛋白，采用免疫印迹(Western-blot)法测定不同乳腺癌细胞中Caveolin-1蛋白的表达情况。
　　将MDA-MB-453/Cav-1细胞MDA-MB-453/pcDNA3.1细胞和MDA-MB-453细胞分别接种于35mm培养皿中，利用实时定量PCR检测稳定转染细胞中Caveolin-1 mRNA的表达水平。
　　结果:
　　1.乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453的Caveolin-1表达情况
　　1.1Western blot检测转染后细胞Caveolin-1的蛋白表达水平Western blot检测转染后MDA-MB-453细胞Caveolin-1的蛋白水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的表达水平分别为0.02±0.00，0.02±0.00，0.60±0.03，MDA-MB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的表达水平明显高于对照组，有统计学意义(P＜0.01)。
　　1.2实时定量PCR检测Caveolin-1的mRNA的表达水平
　　实时定量PCR检测MDA-MB-453稳定转染细胞Caveolin-1 mRNA的表达水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的mRNA表达水平分别为1.00±0.00、1.12±0.05、7.09±0.43，MDA-MB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的表达水平明显高于对照组(1.00)，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　2.乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453的增殖情况
　　将乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453接种于96孔板，分别经0nM、4nM、20nM、100nM刺激后，MTT法检测各孔的OD值进行统计分析，MDA-MB-453/Cav-1组的OD值为0.80±0.07，0.86±0.03，0.93±0.03，1.00±0.03，均明显低于对照组的OD值0.93±0.05，1.02±0.04，1.12±0.06，1.32±0.09，有显著统计学意义（P＜0.01）。
　　第三部分：Caveolin-1对乳腺癌细胞HER-2活化的影响
　　目的：
　　探讨Caveolin-1对乳腺癌细胞HER-2活化的影响
　　方法:
　　Western blot检测稳定转染细胞的Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin的蛋白表达情况。
　　实验分为两组:pcDNA3.1-Cav1转染组和pcDNA3.1转染对照组，培养并用嘌呤霉素筛选乳腺癌稳定转染MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1细胞，每组分别于EGF刺激0min、5min、10min、30min后收集细胞，提取蛋白，Western-blot检测各时间点Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin蛋白的表达情况，统计分析。
　　结果:
　　过表达Caveolin-1对乳腺癌细胞HER-2活化的影响
　　统计结果显示，pcDNA3.1-Cav1组各时间点Caveolin-1的表达水平（1.12±0.03，1.08±0.06，1.13±0.06，1.11±0.04）均明显高于对照组(0.05±0.01，0.04±0.01，0.04±0.00，0.04±0.01)的表达水平，均有统计学意义(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1组磷酸化HER-2分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平（0.98±0.04，0.50±0.03，0.20±0.01）均明显低于对照组（1.25±0.03，1.07±0.03，0.50±0.02）的表达水平，均有统计学意义(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1组磷酸化Akt分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平（0.50±0.01，0.67±0.03，0.42±0.01）均明显低于对照组（0.85±0.05，1.20±0.08，0.82±0.04）的表达水平，均有统计学意义(P＜0.01);pcDNA3.1-Cav1组磷酸化ERK分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平（0.58±0.01，0.80±0.03，0.45±0.01）均明显低于对照组（0.93±0.02，1.10±0.06，0.72±0.05）的表达水平，均有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论:
　　1.Caveolin-1在正常乳腺上皮细胞高表达;Caveolin-1在浸润性乳腺癌组织中的表达较低。
　　2.Caveolin-1的高表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，表明Caveolin-1对乳腺癌细胞的增殖和转移具有抑制作用。
　　3.Cav-1通过调控乳腺癌细胞HER-2磷酸化水平，影响Ras/Raf/MAPK及PI3K/Akt信号转导通路的活化，进而影响浸润性乳腺癌的恶性程度和预后，以及乳腺癌细胞一系列生物学行为。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 Caveolin-1在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 Caveolin-1对乳腺癌细胞生物学行为的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 Caveolin-1对乳腺癌细胞HER-2受体活化的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 Caveolin-1及其与肿瘤发生发展的关系

致谢

个人简历