颗粒细胞骨形态发生蛋白-9评估IVF卵母细胞成熟及胚胎发育

摘要

目的：在体外受精-胚胎移植（In vitro ferti1ization-embryo transfer， IVF-ET, IVF）过程中，能够准确判断卵母细胞成熟度对于受精、胚胎发育、妊娠的建立以及胎儿发育具有深刻的影响。提高卵母细胞成熟度对改善IVF妊娠结局具有重大意义。骨形态发生蛋白-9（Bone morphogenetic protein-9, BMP-9）是骨形态发生蛋白家族（Bone morphogenetic protein, BMP）中的一种，大量存在于肝脏，具有诱导和维持胚胎神经元的类胆碱分化、调节葡萄糖和脂肪酸代谢、调节体内铁的动态平衡等多种重要功能，是目前已知的BMPs中诱导成骨能力最强的因子。近期有研究发现BMP-9在大鼠原始颗粒细胞对类固醇生成存在作用，因此我们推测BMP-9可能存在人卵巢颗粒细胞中并参与生殖系统的调节。
　　本研究检测 IVF-ET助孕患者颗粒细胞中 BMP-9水平，分析其与年龄、体重指数（Body mass index, BMI）、受精率、优质胚胎率，卵子利用率之间的关系，探讨BMP-9对卵子质量、受精及胚胎发育的影响。
　　方法：
　　选取2015年4月至2015年7月于河北医科大学第四医院生殖医学科接受常规 IVF-ET，采用长方案控制性促排卵治疗的患者作为研究对象，共85例。年龄20-38周岁；窦卵泡数≥7个；月经周期规律。采用免疫细胞化学法检测 BMP-9在颗粒细胞中的表达定位，逆转录 PCR（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测颗粒细胞中BMP-9 mRNA和蛋白的表达水平。
　　控制性促排卵治疗：患者均采用长方案治疗，于黄体期中期开始用药，皮下注射促性腺激素释放激素激动剂（Gonadotrophin releasing hormone agonist, GnRHa）1.4mg，第14天测定血清卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone, FSH）、黄体生成素（Luteinizing hormone, LH）、雌二醇（Estradiol, E2）水平，并 B超下监测卵泡大小及子宫内膜(Endometrium, EM)厚度，达到降调节水平（LH≤2.5IU/L, FSH≤3IU/L, E2≤30pg/ml, EM≤5mm），后给予重组人促卵泡激素注射液（r-FSH）150-225IU促排卵，超声监测子宫内膜及卵泡生长情况，必要时抽取肘静脉血监测 LH、E2、孕激素（Progesterone, P）水平，当有2个卵泡直径大于20mm，且血清E2水平为每个卵泡约200-300pg/ml时，当晚注射艾泽250μg（重组人绒促性素注射液，意大利）。36-37h后经阴道超声指导下取卵。
　　卵母细胞及胚胎评价：评估卵子颗粒细胞复合体采用 MⅡ卵评分系统。受精后16～20小时采用 SCOTT合子评分标准，观察受精卵的原核形态。受精卵继续培养48小时，采用卵裂期胚胎评分标准进行评分，检查胚胎发育情况。
　　颗粒细胞采集：留取全部卵泡液，收集细胞沉淀。50％的Percoll细胞分离液分离颗粒细胞，红细胞裂解液裂解残留的红细胞，PBS洗涤后离心，下层即为颗粒细胞。部分颗粒细胞加入2ml Trizol液完全裂解后置于-80℃冻存，用于RT-PCR实验；部分-80℃直接冻存，用于Western blot实验；另留取少量颗粒细胞涂片，4%多聚甲醛固定后用于免疫细胞化学实验。
　　免疫细胞化学法：对颗粒细胞进行固定及透化处理；封闭内源性过氧化物酶及非特异性结合位点。一抗采用兔抗人多克隆BMP-9抗体（山羊血清按照1:200）（ABCAM)，阴性对照以PBS代替一抗，并按照免疫细胞化学法进行检测。Leica显微照相系统进行图像釆集。
　　RT-PCR技术：Trizol法提取颗粒细胞中的总 RNA，反转录采用PROMEGA试剂盒，按照说明书进行。以β-actin为内参，将目的基因扩增。产物于20g/L的琼脂糖凝胶电泳，目的基因与内参扩增产物电泳条带亮度密度比值为BMP-9 mRNA的相对表达量。
　　Western Blot：细胞裂解液裂解颗粒细胞；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳；分离蛋白条带，转移至PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭1小时；将PVDF膜放入BMP-9抗体工作液（1∶1000）中，4℃过夜；TBST洗膜三次；加二抗孵育1小时，用TBST液洗膜三次。β-actin为内参。用双色红外激光扫描器进行扫描，记录灰度值，目的条带与内参照的光密度比值为BMP-9蛋白的相对表达量。
　　统计分析：所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示,组间差异采用t检验，P<0.05即有显著性差异。对相关的计量资料采用Person相关系数进行相关性分析。
　　结果：
　　1.BMP-9定位表达于人颗粒细胞胞浆，个体间表达水平有差异（图1）。
　　2.颗粒细胞中BMP-9mRNA的表达
　　2.1.颗粒细胞中BMP-9mRNA的表达同患者的年龄、BMI、bFSH、bLH、GN总量、GN天数均无直线相关关系（表1）。
　　2.2.颗粒细胞中BMP-9mRNA表达同患者的获卵数、受精数、MⅡ卵数、2PN数、受精率、优质胚胎率、卵子利用率均无直线相关关系（表2）。3颗粒细胞中BMP-9蛋白的表达
　　3.1.颗粒细胞中BMP-9蛋白的表达个体水平间存在差异（图2）。
　　3.2.颗粒细胞中 BMP-9蛋白的表达同患者的年龄、BMI、bFSH、bLH、GN总量、GN天数均无直线相关关系（表1）。
　　3.3.颗粒细胞中BMP-9蛋白表达同患者的获卵数、MⅡ卵数、受精数、2PN数、受精率、优质胚胎率、卵子利用率均无直线相关关系（表2）。
　　4.颗粒细胞中 BMP-9 mRNA表达同蛋白表达的相关系数为0.220， P=0.043，存在相关关系（图3）。
　　5.根据BMP-9 mRNA的相对表达量（0.155-0.690），选取均数0.403为节点，分为低表达组（n=41）和高表达组（n=44）（图4），两组间基础资料无统计学差别（表3）。BMP-9mRNA高表达组优质胚胎率、卵子利用率高于低表达组，有统计学差别(P<0.05)（表4）。
　　结论：
　　1.BMP-9 mRNA及蛋白在人类卵巢颗粒细胞中均有表达。BMP-9蛋白表达于颗粒细胞胞浆中，可能作为自分泌/旁分泌因子参与生殖系统调控。
　　2.BMP-9 mRNA同蛋白质的表达具有直线相关关系。
　　3.BMP-9高表达可提高优质胚胎率，改善卵母细胞质量，说明BMP-9或可成为评估卵子质量的指标之一。

目录

声明

英文缩写

前言

材料和方法

1 实验试剂及仪器

2 研究对象

3 标本采集及实验方法

4 统计分析

结果

附图

附表

讨论

1 卵母细胞和颗粒细胞的关系

2卵巢自分泌旁分泌

3 BMP家族在生殖过程中作用

4 BMP-9研究介绍

5 BMP-9与卵母细胞质量的研究

6 展望

结论

参考文献

综述:骨形态发生蛋白家族在生殖系统的研究

致谢

个人简历