基于Rho激酶信号通路观察消痰化瘀利窍方对慢性间歇性低氧大鼠主动脉内皮功能的影响

摘要

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）主要是以睡眠中上呼吸道障碍造成的呼吸不畅或者呼吸暂停为特征，引起慢性间歇性低氧（CIH），使血氧饱和度降低和睡眠结构紊乱。OSAS是一个公共健康问题，在男性和女性中的患病率分别为3-7％和2-5%。研究发现，OSAS是增加许多心血管疾病发病率和死亡率的一个重要风险因素，可诱发肺动脉高压、糖尿病、认知功能障碍、心肌缺血、脑卒中等并发症，尤其是高血压的独立危险因素。现代医学对OSAS患者一般采用药物干预治疗、口腔矫治器治疗、呼吸机持续气道正压通气（CPAP）治疗以及外科手术治疗等，然而，到目前为止，各种治疗措施疗效并不十分理想。OSAS属于祖国医学“鼾症”范畴，消痰化瘀利窍方是该校OSAS中医针药防治团队根据多年临床经验总结出的治疗脾虚失运、肺气失宣、痰阻血瘀型鼾症的经验方，经过临床验证能有效缓解患者症状，预防各种并发症的发生。
　　本研究主要观察中药消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉内皮功能的保护作用，并探讨RhoA/ROCK信号通道在消痰化瘀利窍方保护内皮损伤过程中的作用机制。
　　目的：研究消痰化瘀利窍方对CIH诱导的大鼠内皮损伤的保护作用。通过对尾动脉压(SBP)、血清中NO、血浆中ET-1、主动脉内皮细胞组织病理学改变的检测来判断消痰化瘀利窍方对CIH诱导的大鼠内皮损伤的保护作用。利用Western blot检测ET-1、eNOS、p-eNOS、RhoA、ROCK、p-MYPT-1的蛋白表达水平，探讨消痰化瘀利窍方对CIH诱导的大鼠内皮损伤的潜在机制。
　　方法：成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重180-220g，购于河北医科大学动物中心，大鼠随机分成5组（n=10）：常氧对照组（Normoxia）、慢性间歇性低氧组（CIH）、消痰化瘀利窍方低剂量组（XL+CIH）、消痰化瘀利窍方中剂量组（XM+CIH）、消痰化瘀利窍方高剂量组(XH+CIH)。除常氧对照组外，其他组暴露于CIH环境中，低、中、高剂量组分别给予不同浓度（生药量24 g/kg，48 g/kg，96 g/kg）的消痰化瘀利窍方灌胃，每天在上舱前半个小时进行。慢性间歇性低氧舱系统运作：前1.5 min向舱内充入100%氮气使O2浓度降低到9%，后1.5 min充入医用氧（>99.5%）使O2浓度逐渐恢复到21%，每一低氧复氧循环的时间为3 min，每天8小时，一共暴露21天。造模结束后，取大鼠主动脉进行实验研究。造模前一天17时测量尾动脉收缩压（SBP），每周测量一次，记录每只大鼠的SBP。造模结束后，SD大鼠禁食禁水12小时后，股动脉取血，用于检查血液的各项指标。接着用25%乌拉坦腹腔注射麻醉，腹部表面用75％乙醇灭菌，然后进行垂直切口以暴露腹腔和胸部，定位主动脉弓，沿着脊柱分离血管，并将其与结缔组织分离。取一部分主动脉放于4%多聚甲醛中固定，其余组织保存于-80℃冰箱中。
　　采用生物化学技术检测血清中NO、血浆中ET-1的含量。对主动脉组织进行HE染色。利用Western blot测定主动脉组织中ET-1、eNOS、p-eNOS、RhoA、ROCK、p-MYPT-1的蛋白表达变化。
　　结果：
　　1.消痰化瘀利窍方对CIH大鼠尾动脉压的影响:与常氧对照组（147±1.48 mmHg）相比，CIH组在造模第21天结束后尾动脉压显著升高至158±3.44 mmHg。与CIH组相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组均可有效降低CIH诱导的尾动脉压升高，至造模结束血压分别为148±2.65 mmHg，149±3.43 mmHg，149±3.57 mmHg。
　　2.消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉内皮组织形态学改变的影响:通过HE染色观察，常氧对照组主动脉结构正常，内膜光滑，内皮细胞完整、排列有序。CIH组大鼠主动脉内皮不光滑，内皮细胞部分剥脱，胞体缩小，核小深染。与CIH组相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组中主动脉内皮细胞组织损伤减轻。
　　3.消痰化瘀利窍方对CIH大鼠血清NO、血浆ET-1含量的影响:与常氧对照组（38.1±2.10mol/L）相比，CIH组大鼠血清NO含量显著性降低至28.9±2.23mol/L。与CIH组大鼠相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组血清NO含量增加，分别为35.7±1.72mol/L，36.7±1.22mol/L，38.5±1.15mol/L，具有剂量依赖性。与常氧对照组（79.4±4.05 pg/mL）相比，CIH组大鼠血浆ET-1含量显著性升高至97.9±3.24 pg/mL。与CIH组大鼠相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组血浆ET-1含量降低，分别为85.8±1.75 pg/mL，83.9±3.5 pg/mL，82.1±4.4 pg/mL，具有剂量依赖性。
　　4.消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉ET-1蛋白表达的影响:与常氧对照组（0.350±0.0295）相比，CIH组大鼠主动脉ET-1表达显著增加至1.04±0.0667。与CIH组大鼠相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组ET-1表达降低，分别为0.831±0.0254，0.814±0.0275，0.684±0.0232，具有剂量依赖性。
　　5.消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉eNOS蛋白及其磷酸化水平表达的影响:eNOS的磷酸化作为eNOS活性的标志物。与常氧对照组（eNOS:1.10±0.0954，p-eNOS:0.670±0.0443）相比，CIH大鼠主动脉中eNOS蛋白表达显著降低至0.411±0.0266；p-eNOS蛋白表达显著降低至0.267±0.0128）；与CIH组相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组eNOS蛋白表达明显增加，分别为0.567±0.0444，0.602±0.0223，0.736±0.0250；p-eNOS蛋白表达明显增加，分别为0.324±0.0120，0.424±0.0216，0.578±0.0286，具有剂量依赖性。
　　6.消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉RhoA/ROCK信号通道蛋白表达的影响:与常氧对照组（RhoA:0.508±0.0638，ROCK:0.174±0.0316）相比， CIH组大鼠主动脉组织中RhoA1.29±0.0341；ROCK表达升高至1.10±0.0499。与CIH组相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组能够降低RhoA蛋白表达，分别为0.955±0.0796，0.831±0.104，0.6594±0.0710；显著降低ROCK蛋白表达，分别为0.834±0.0624，0.586±0.0395，0.310±0.0652，具有剂量依赖性。
　　7.消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉p-MYPT-1蛋白表达的影响:因为MYPT-1是RhoA/ROCK信号通道的最主要的一个下游通道介导Ca2+的敏感性和调节肌球蛋白轻链（MLC）的活性。通过检测MYPT-1的磷酸化水平来判断RhoA/ROCK信号通道的活化情况。与常氧对照组（0.339±0.0656）相比，CIH组大鼠主动脉组织中p-MYPT-1表达升高至1.03±0.0241。与CIH组相比，消痰化瘀利窍方低、中、高剂量组能够降低p-MYPT-1表达0.705±0.0213，0.506±0.0170，0.359±0.0251，有明显的剂量依赖性。
　　结论：消痰化瘀利窍方可显著降低CIH大鼠血压，并可有效干预内皮功能损伤，其内皮保护机制可能与抑制CIH诱发的RhoA/ROCK信号通路激活，调节eNOS，p-eNOS，NO，ET-1有关。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1材料

2 方法

3 统计学分析

结果

3 消痰化瘀利窍方对CIH大鼠血清NO、血浆ET-1含量的影响

4 消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉ET-1蛋白表达的影响

5 消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉eNOS蛋白及其磷酸化水平表达的影响

6 消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉RhoA/ROCK信号通道蛋白表达的影响

7 消痰化瘀利窍方对CIH大鼠主动脉p-MYPT-1蛋白表达的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:慢性间歇性低氧诱导高血压的机制探讨

致谢

个人简历