血清饥饿应激情况下骨髓瘤细胞来源微泡对内皮细胞血管新生的影响

摘要

目的：肿瘤的生长离不开营养物质的支持，当肿瘤增长到一定程度时会发生营养缺乏的现象，肿瘤细胞会通过血管的新生来维持自身的生长，因此血管新生在肿瘤生长过程中具有十分重要的作用。多发性骨髓瘤细胞对血管新生的依赖性已经得到了公认，虽然很多抗血管新生药物有一定疗效但仍然摆脱不了耐药现象。已有研究显示血清饥饿应激（serum deprivation, SD）情况下骨髓瘤细胞来源微泡（MM-MVs）促进内皮细胞小管形成，提示微泡在肿瘤血管新生过程中有重要作用。本课题拟进一步研究血清饥饿应激情况下，MM-MVs对内皮细胞迁移能力、小管形成及VEGF分泌水平的影响。此项目的完成将为应激情况下肿瘤细胞与微环境之间对话机制提供新的研究模式，为克服肿瘤的血管新生治疗抵抗提供新的策略。
　　方法：培养KM3、U266、RPMI8226三种多发性骨髓瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞分为两组,分别给予10％FBS的正常培养条件，1%FBS的血清剥夺应激（SD)培养条件，培养24h后经典差异离心法收集三种多发性骨髓瘤细胞正常培养和SD情况下分泌的微泡。正常培养和SD情况下三种多发性骨髓瘤微泡设为实验组，共6个实验组，并设置PBS对照组和VEGF（25ng/ml）阳性对照。(1)划痕实验：六孔板培养内皮细胞12h后，MVs和SD-MVs与内皮细胞共孵育，用无血清DMEM进行培养，36h后倒置显微镜下观察各组内皮细胞横向迁移情况，用划痕处面积大小来表示。(2)transwell迁移实验：transwell小室上室加入内皮细胞悬液，下室分别加入MVs、SD-MVs和VEGF、PBS，共孵育5h后对小室进行固定染色，倒置显微镜下观察各组内皮细胞纵向迁移情况，用迁移到小室下室面的细胞数量来表示。(3)小管形成实验：96孔板底部涂Matrigel基质胶，加入内皮细胞悬液，MVs和SD-MVs与内皮细胞共孵育6h后，倒置显微镜下观察各组小管形成的情况。用小管形成数量来表示。(4) ELISA试剂盒检测MVs和SD-MVs与内皮细胞共孵育前后HUVEC上清VEGF的变化情况。
　　结果：
　　1.划痕实验结果显示：骨髓瘤MVs和SD-MVs实验组与PBS对照组相比有显著差异， MVs和SD-MVs组较PBS对照组划痕面积小，且SD-MVs组较MVs划痕面积小，RPMI8226 SD-MVs实验组与VEGF对照组相比无显著差异。结果说明骨髓瘤MVs促进HUVEC的横向迁移,且SD-MVs与MVs相比促进HUVEC横向迁移能力更为显著。
　　2.迁移实验结果显示：骨髓瘤MVs和SD-MVs实验组与PBS对照组有显著差异，MVs和SD-MVs组较PBS对照组迁移细胞量多；且SD-MVs组较MVs组迁移到小室下室面的细胞数多。RPMI8226 SD-MVs实验组与VEGF对照组无显著差异。结果说明骨髓瘤MVs促进HUVEC的纵向迁移能力，且SD-MVs与MVs相比促HUVEC纵向迁移能力更为显著。
　　3.小管形成实验结果显示：骨髓瘤MVs和SD-MVs实验组与PBS对照组有显著差异，MM-MVs有显著促小管生成的能力；且SD-MVs组的促小管生成能力较MVs组更为显著。RPMI8226 SD-MVs实验组与VEGF对照组相比无显著差异。结果说明骨髓瘤MVs促进HUVEC的小管形成，且SD-MVs与MVs相比促HUVEC小管形成能力更为显著。
　　4.ELISA实验结果显示：骨髓瘤MVs和SD-MVs实验组与PBS对照组有显著差异，MVs和SD-MVs较PBS对照组促内皮细胞分泌更高水平的VEGF；且SD-MVs组较MVs组内皮细胞分泌VEGF的水平更为显著。
　　结论：
　　1.MM-MVs促进HUVEC迁移和小管形成。
　　2.SD应激情况下分泌的MVs与正常培养条件下分泌的MVs相比促血管新生作用更为显著。
　　3.MM-MVs与HUVEC共孵育后增加其VEGF的分泌水平，且SD-MVs组较MVs组内皮细胞分泌VEGF的水平更为显著。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 划痕实验结果

2 迁移实验结果

3 小管形成实验

4 ELISA检测VEGF结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:肿瘤胞外囊泡与肿瘤微环境

致谢

个人简历