纳米级炭黑颗粒对16HBE细胞毒性作用及影响因素的研究

摘要

目的:炭黑（carbon black,CB）是一种超细碳粒子，是燃料不完全燃烧时产生的烟尘中的主要组成部分。炭黑纳米颗粒（carbon black nanoparticles,CBNPs）是通过控制碳氢化合物的气相裂解过程生产制造而成的纯的炭黑粉末，随着CBNPs的商业化及CB向大气的排放量持续升高，CBNPs的暴露与人类健康风险的评估备受关注。有研究证明处于不同周期的细胞会对纳米颗粒的摄取量存在差异，而细胞内纳米颗粒的含量与其所引起的细胞毒性密切相关。目前CBNPs对细胞产生的毒性损害以及不同细胞周期对于细胞的CBNPs摄取量是否产生影响尚不清楚，因此探究CBNPs产生的细胞损伤作用及不同周期对细胞摄取CBNPs量的影响具有十分重要的意义。本研究通过研究不同细胞周期对人支气管上皮细胞（16HBE）的CBNPs摄取量的影响为切入点，探究CBNPs对16HBE的细胞毒性效应及其影响因素。
　　方法：
　　1.纳米炭黑颗粒表征观察
　　通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察纳米炭黑的结构特征。采用粒径分析仪分析纳米炭黑的粒径，BET比表面积测试法测量炭黑颗粒比表面积。
　　2.细胞培养和细胞模型建立
　　16HBE（中国典型培养物保藏中心）用含10％热灭活胎牛血清的MEM培养基37℃，5%CO2饱和湿度下进行培养。选择对数生长期的细胞，用CBNPs处理24小时，剂量分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；以MEM（含0.04%Tween80）为阴性对照。
　　3.MTT法检测细胞存活率
　　分别使用阴性对照组和1、10、50、100、200、300μg/mL CBNPs染毒组处理16HBE细胞3、6、12、24、36h。加入MTT孵育后使用酶标仪检测各孔在495nm波长处的吸光度值。每组设置六个复孔，计算各组吸光度并统计各染毒组细胞存活率。
　　4.细胞氧化应激水平的测定
　　将CBNPs染毒处理后的细胞制备成单细胞悬液，用2,7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（2,7-dichlorodihydrf-luorescein diacetate,DCFH-DA）荧光探针进行孵育，流式细胞仪检测不同剂量CBNPs处理后16HBE细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的含量；16HBE细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及脂质过氧化产物丙二醛（malonaldehyde， MDA）含量采用生化试剂盒并按照说明书进行定量检测。
　　5.细胞DNA损伤的测定
　　应用单细胞凝胶电泳（single cell gel ectrophoresis，SCGE）实验，通过观测染毒前后Olive尾踞的变化，检测CBNPs对细胞DNA的损伤。
　　6.AnnexinⅤ-PI双染检测细胞凋亡
　　染毒24小时后将阴性对照和各染毒组细胞制备成单细胞悬液，采用AnnexinⅤ-FITC和PI双染标记，于流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　7.细胞周期检测
　　将阴性对照和各染毒组制备成单细胞悬液，用-20℃预冷的80%的乙醇固定后，先后使用RNAseA和PI处理细胞，之后使用流式细胞仪进行周期检测。
　　8.细胞周期的同步化
　　使用害羞草碱使16HBE细胞同步于G0/G1期，胸苷双阻断法使16HBE细胞同步于S期，诺考达唑使细胞同步于G2/M期。
　　9.细胞摄取CBNPs检测
　　将阴性对照和各染毒组16HBE细胞制备成单细胞悬液，经PBS洗涤两次后，应用流式细胞仪进行检测，并通过 SSC密度含量的改变来定量分析16HBE对 CBNPs的摄取量。另外采用ImageStreamX单细胞成像流式细胞仪检测各组样本并获取各剂量组细胞的明场及暗场图像和数据，由此分析16HBE摄取CBNPs的情况。
　　结果：
　　1.纳米炭黑颗粒表征
　　电子显微镜下观察，纳米炭黑为球状颗粒。透射电镜显示炭黑颗粒大体呈葡萄球状，分散良好，颗粒直径在30~50nm之间。扫描电镜显示炭黑颗粒近似呈球形，分散较均匀，团聚颗粒直径大约200~400nm之间。较大颗粒表面有很多球形突出物。利用 BET比表面积测试法测量炭黑颗粒比表面积为74.85m2/g。炭黑颗粒难溶于水，在水溶剂中炭黑团聚颗粒直径为200~400nm，而在0.04%Tween80中有较好的分散性，颗粒直径为30~50nm。
　　2.CBNPs对16HBE细胞活性的影响
　　当用100、200和300μg/mL CBNPs处理16HBE细胞3h后，各剂量组细胞存活率逐渐降低（P<0.05）；当用50、100、200和300μg/mL CBNPs处理16HBE细胞6h后，各剂量组细胞存活率逐渐降低（P<0.05）；当用1、10、50、100、200和300μg/mL CBNPs处理细胞12、24、36h后，各剂量组细胞存活率逐渐降低（P<0.05）；随着染毒浓度和时间的增加，16HBE细胞活性降低更加明显。这些结果表明CBNPs抑制16HBE细胞存活并且这种抑制效应存在剂量和时间依赖性。
　　3.CBNPs诱导16HBE细胞凋亡
　　用50、100和200μg/mL的CBNPs处理16HBE细胞24小时。发现50μg/mL和100μg/mL CBNPs处理的16HBE早期凋亡细胞数目略微升高（P>0.05）；200μg/mL CBNPs处理可诱导16HBE细胞早期凋亡率显著增加（P<0.05）；随着CBNPs染毒浓度增加，晚期凋亡细胞所占的百分率和细胞坏死细胞的百分率逐渐升高（P<0.05）。这些结果表明CBNPs对细胞增殖的抑制作用至少可以部分解释为CBNPs诱导的凋亡和坏死。
　　4.CBNPs对16HBE细胞氧化损伤的测定
　　不同浓度CBNPs处理16HBE细胞24小时后，随着染毒浓度的增加， ROS水平逐渐升高（P<0.05）；MDA含量逐渐增加（P<0.05）；SOD和GSH-Px活力随CBNPs染毒浓度的增加而逐渐降低（P<0.05）。说明CBNPs可以诱导16HBE细胞氧化损伤。
　　5.CBNPs对16HBE细胞DNA损伤的诱导作用
　　不同剂量的CBNPs处理16HBE细胞24小时后，随着染毒浓度的增加，各剂量组Olive尾距显著增加，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。说明CBNPs可以诱导16HBE细胞DNA损伤。
　　6.CBNPs对16HBE细胞周期的影响
　　用100μg/mL CBNPs对16HBE细胞进行连续处理，发现CBNPs诱导S期和 G2/M期细胞比率增加（P<0.05）。S期细胞比率增加发生在6至24小时; G2/M期细胞比率增加发生在18至36小时。说明CBNPs诱导16HBE细胞周期阻滞，且阻滞发生于S期和G2/M期。
　　7.16HBE细胞对CBNPs的摄取
　　用50、100和200μg/mL的CBNPs处理16HBE细胞24小时，采用流式细胞仪和 ImageStreamX成像流式细胞仪进行检测。发现细胞内CBNPs量逐渐升高（P<0.05）；将16HBE细胞分别同步化于G0/G1期，S期和G2/M期并进行CBNPs染毒处理。经6小时和24小时染毒后采用流式细胞仪检测观察到同步于S期和G2/M期的16HBE细胞比同步于G0/G1期的16HBE细胞有更高的CBNPs摄取量，其中同步于G2/M期的16HBE细胞对CBNPs摄取量最高，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。这表明不同细胞周期阶段可以影响16HBE细胞对CBNPs的摄取效果。不同细胞周期各阶段对 CBNPs的摄取量由多到少排序为 G2/M期>S期>G0/G1期。
　　结论：
　　1.CBNPs处理能够诱导16HBE细胞发生活性降低、凋亡率增加、活性氧水平升高、DNA损伤等急性毒性损伤，且这些损伤与16HBE摄取的CBNPs数量相关。
　　2.S期及G2/M期是16HBE细胞摄取CBNPs的重要时期。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 纳米炭黑颗粒的表征

2 CBNPs对16HBE细胞活性的影响

3 CBNPs对16HBE细胞氧化损伤作用

4 细胞DNA的损伤

5 CBNPs诱导16HBE细胞凋亡

6 CBNPs对16HBE细胞周期的影响

7 16HBE细胞对CBNPs的摄取

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:纳米材料免疫毒性研究进展

致谢

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